增强聚阳离子疏水性优化mRNA多聚体疫苗诱导体液和细胞免疫的效果研究

本研究针对mRNA多聚体疫苗在传染病应用中免疫诱导效率不足的问题，通过设计可生物降解的两性聚天冬酰胺衍生物PAsp(DET/CHE)，系统优化疏水性基团2-环己基乙基(CHE)的引入比例。研究发现增加CHE比例显著激活NLRP3炎症小体通路，增强树突状细胞活化，并提高引流淋巴结的抗原表达效率，最终在小鼠模型中实现对模型抗原和SARS-CoV-2刺突蛋白的高效体液(IgG/IgG1/IgG2a)和细胞免疫(CD4+ /CD8+ T细胞)诱导。该研究为传染病mRNA疫苗的聚合物载体设计提供了重要策略。

　　

在COVID-19疫情推动下，mRNA疫苗技术展现了巨大潜力，但现有脂质纳米颗粒(LNP)载体存在肝靶向性强、系统性分布等局限性。相比之下，聚合物基mRNA递送系统(polyplex)虽具有合成可调、安全性高等优势，但其在传染病疫苗中的应用效果长期逊于LNP，尤其在诱导平衡的体液和细胞免疫方面面临挑战。这一瓶颈主要源于polyplex的免疫刺激佐剂性(adjuvanticity)不足，以及淋巴结靶向效率有限。

为解决这一关键问题，日本东京大学的研究团队基于可生物降解的两性聚天冬酰胺衍生物PAsp(DET)，通过引入不同比例的疏水性2-环己基乙基(CHE)基团，构建了系列聚合物PAsp(DET/CHE)₂₆
（数字代表聚合度）。研究发现，当CHE引入比例提升至60-70%时，polyplex通过激活NLRP3炎症小体通路显著增强树突状细胞成熟标志物(CD40/CD86)表达，并提高引流淋巴结的抗原表达效率。在三次免疫BALB/c小鼠实验中，高CHE比例polyplex成功诱导针对模型抗原(OVA)和SARS-CoV-2刺突蛋白的强效抗体反应(IgG滴度提升100倍)和Th1偏向的细胞免疫(IFN-γ⁺
CD8⁺
T细胞增加5倍)，且蛋白表达局限于注射部位和引流淋巴结，避免了LNP引发的系统性炎症反应。该成果发表于《Biomaterials》，为传染病mRNA疫苗的聚合物载体设计提供了分子层面的优化策略。

研究采用的关键技术包括：1）动态光散射和透射电镜表征polyplex理化性质；2）HiBiT-THP-1报告系统检测NLRP3炎症小体激活；3）流式细胞术分析树突状细胞成熟标志物(CD40/CD86)和生发中心B细胞(GL7⁺
CD38^-
)；4）ELISpot和细胞内细胞因子染色(ICS)评估抗原特异性T细胞反应；5）活体成像系统(IVIS)追踪mRNA在体内的表达分布。

2.1 不同疏水性mRNA多聚体的制备与表征
通过控制DET与CHE的投料比，合成出CHE引入比例为0-70%的PAsp(DET/CHE)₂₆
。电镜显示所有polyplex均呈规则球形（直径约100nm），随着CHE比例增加，polyplex对核糖核酸酶(RNase)和硫酸葡聚糖的抵抗能力显著增强（CHE70组mRNA保留率达80%），且4℃储存稳定性提高。

2.2 培养细胞中的mRNA递送效率与佐剂性
在DC2.4树突状细胞和原代骨髓来源树突状细胞(BMDC)中，CHE40-70组展现最高蛋白表达效率（荧光素酶活性提升20倍）。机制研究表明，高CHE比例polyplex通过溶酶体膜 destabilization 激活NLRP3/caspase-1通路（IL-1β分泌量增加8倍），并显著上调共刺激分子CD40/CD86表达（p<0.0001）。

2.3 体内mRNA递送效率分析
小鼠足垫注射实验显示，CHE50-70组在引流淋巴结（腘窝淋巴结）的荧光素酶表达强度比CHE0组高3倍（p=0.0069），且无肝脏等器官的异位表达，与LNP形成鲜明对比。

2.4 模型抗原OVA的免疫效果
三次免疫后，CHE60-70组诱导的OVA特异性IgG滴度达1:10⁵
，并伴随生发中心B细胞比例增加3倍（p<0.001）。ELISpot检测显示IFN-γ⁺
T细胞数量与MC3-LNP对照组相当。

2.5 SARS-CoV-2刺突蛋白疫苗接种
针对4.2kb的长链刺突蛋白mRNA，CHE70组诱导的IgG2a/IgG1比值>1（Th1型反应），并检测到IL-2⁺
CD8⁺
T细胞（具有干细胞样特性）。安全性评估显示，polyplex组血浆IL-6水平始终低于检测限，而LNP组引发显著肝脏炎症反应（IL-6 mRNA上调1000倍）。

该研究系统论证了polycation疏水性在mRNA疫苗设计中的双重作用：CHE基团既通过增强polyplex稳定性提高递送效率，又通过NLRP3通路激活获得理想佐剂性。区别于LNP的肝靶向特性，polyplex的局部淋巴结富集特性使其在避免系统性副作用方面具有独特优势。未来研究可进一步探索该平台在癌症疫苗中的应用，并通过优化聚合物分子量、电荷密度等参数提升抗体诱导效率。这一工作为传染病防治提供了除LNP外的聚合物载体解决方案，具有重要的临床转化价值。