利用工程化米曲霉酶鸡尾酒与酵母辅助纯化高效生产异蔗糖苷

本研究针对植物细胞壁复杂多糖木葡聚糖难以高效转化为功能性稀有二糖异蔗糖苷（isoprimeverose）的难题，通过构建产异蔗糖苷酶（IpeA）和内切葡聚糖酶（EG）的两种基因工程米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株，开发了酶鸡尾酒协同降解技术，实现木葡聚糖90%理论转化率的高效水解，并创新性采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）去除副产物葡萄糖和半乳糖。该研究为稀有功能性糖的工业化生产提供了仿传统清酒发酵的绿色解决方案。

　　

在功能性食品添加剂领域，稀有糖因其独特的生理活性备受关注。异蔗糖苷（isoprimeverose）作为一种存在于植物细胞壁木葡聚糖（xyloglucan）中的稀有二糖，被认为具有潜在益生元特性。然而，其工业化生产面临两大瓶颈：一是天然木葡聚糖结构复杂，常被半乳糖、阿拉伯糖等修饰，单一酶难以高效水解；二是传统化学合成法存在产率低、成本高的问题。日本创新生物生产神户中心的研究团队受传统清酒发酵工艺启发，开创性地将米曲霉（Aspergillus oryzae）的酶生产优势与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的糖代谢特性相结合，建立了高效、绿色的异蔗糖苷生产新范式。

研究团队采用基因工程技术构建了两株工程化米曲霉：一株过表达异蔗糖苷酶（IpeA），另一株分泌内切葡聚糖酶（EG）。通过分离培养制备酶鸡尾酒，该组合成功将罗望子木葡聚糖和罗望子籽胶降解，获得14 g/L异蔗糖苷（理论转化率>90%）。针对副产物问题，创新性采用酿酒酵母选择性代谢去除残留的葡萄糖和半乳糖，形成完整的"酶解-纯化"一体化工艺。

关键实验技术

1. 米曲霉基因工程：通过P-sodM启动子和T-glaB终止子调控ipeA基因表达，构建高产IpeA菌株
2. 酶活性分析：采用SDS-PAGE和HPLC检测分泌蛋白及糖类产物
3. 酵母辅助纯化：利用酿酒酵母BY4741选择性消耗单糖副产物

研究结果

Secretory production of IpeA
通过染色体共转化获得IpeA分泌型米曲霉，转化株No.5-1的酶产量达0.5 g-protein/L，显著高于毕赤酵母表达系统（7 mg/L）。SDS-PAGE显示约100 kDa的特异性条带，证实IpeA成功分泌。

Enzymatic degradation of xyloglucan
酶鸡尾酒处理罗望子木葡聚糖24小时后，HPLC检测显示异蔗糖苷为主产物（占木糖基化单元90%），同时存在未完全降解的半乳糖修饰片段。对比实验证实EG的加入使长链木葡聚糖断裂效率提升3倍。

Yeast-assisted purification
酿酒酵母处理12小时后，反应液中葡萄糖和半乳糖含量下降98%，而异蔗糖苷保留率>95%。该过程模拟了清酒发酵中酵母对糖类的选择性代谢特性。

Conclusions
该研究首次实现从复杂植物多糖到高纯度异蔗糖苷的全生物转化，其创新性体现在：① 双菌株策略解决木葡聚糖结构异质性问题；② 酵母纯化步骤替代传统色谱分离，降低成本；③ 整体工艺符合GRAS标准，具备直接食品应用潜力。研究不仅为功能性糖生产提供新思路，更拓展了传统发酵微生物在现代生物制造中的应用边界。

讨论
值得注意的是，该工艺对半乳糖修饰程度不同的木葡聚糖均表现出良好适应性，暗示酶鸡尾酒可能存在未知的协同作用机制。未来研究可进一步优化EG与IpeA的比例，并探索其他酵母菌株对多元糖副产物的清除能力。该成果已发表于《Enzyme and Microbial Technology》，标志着稀有糖生物制造技术的重要突破。