Bacteroides thetaiotaomicron来源的新型GH97家族α-葡萄糖苷酶的比较研究：底物特异性与催化机制的突破性发现

本研究针对糖苷水解酶(GH)家族97中细菌α-葡萄糖苷酶研究匮乏的现状，从Bacteroides thetaiotaomicron中克隆表达Bt_4581、Bt_0683和Bt_3163三种新型酶，通过Ni-NTA纯化与酶学表征，首次揭示GH97家族Group 3成员Bt_3163对α-pNPG的特异性偏好，并发现Bt_4581对奇数葡萄糖单元麦芽寡糖的独特动力学特性，为理解GH97家族催化多样性提供重要依据。

　　

在微生物分解复杂碳水化合物的过程中，糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase, GH)扮演着分子剪刀的关键角色。其中GH97家族因其独特的"双机制"催化特性（既能保留又能反转糖苷键的立体构型）而备受关注，但该家族细菌来源的α-葡萄糖苷酶研究长期处于空白状态。更棘手的是，现有文献对GH97不同亚组（Group）成员的底物偏好性和催化效率缺乏系统比较，这严重阻碍了我们对肠道菌群碳水化合物代谢网络的认知。

针对这一科学瓶颈，来自韩国国立研究机构的研究团队选择人类肠道优势菌种Bacteroides thetaiotaomicron作为研究对象，聚焦其基因组中三个GH97家族基因（Bt_4581、Bt_0683、Bt_3163）。通过基因克隆、蛋白表达与纯化技术，结合精细的酶学分析，首次揭示：Group 1成员Bt_4581展现出对含奇数葡萄糖单元麦芽寡糖（如G3、G5）的显著偏好性，其水解活性严格依赖金属离子；而Group 3代表Bt_3163则被确认为首个特异性作用于α-对硝基苯酚葡萄糖苷(α-pNPG)的GH97酶。这些发现不仅填补了GH97家族功能研究的空白，更为设计靶向肠道菌群的碳水化合物调控策略提供了分子基础。相关成果发表于《Enzyme and Microbial Technology》。

关键技术方法包括：从韩国菌种保藏中心(KCTC)获取B. thetaiotaomicron VPI-5482菌株；采用PCR扩增目标基因并构建pTKNd119表达载体；通过Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白；使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联(GODPOD)法测定酶活；运用高效液相色谱(HPLC)分析水解产物。

【INTRODUCTION】
传统α-葡萄糖苷酶分为EC 3.2.1.20（水解α-糖苷键）和EC 3.2.1.3（葡糖淀粉酶）两类，而GH97家族因其罕见的"双机制"催化特性成为研究焦点。该部分系统梳理了GH酶分类体系（CAZy数据库）和B. thetaiotaomicron的碳水化合物代谢特征。

【Materials and reagents】
实验选用pNPG、pNPGal等硝基苯酚衍生物作为底物，麦芽寡糖系列（G2-G7）作为天然底物，所有酶反应均在50 mM磷酸缓冲液(pH 7.0)体系中进行。

【Cloning, expression, and purification】
成功构建三种重组质粒（pTKNdBt_4581等），SDS-PAGE显示纯化蛋白分子量约80-85 kDa，与理论值相符。

【DISCUSSION】
通过比较Group 1（Bt_4581/Bt_0683）与Group 3（Bt_3163）的酶学特性，发现：1）Group 1酶具有更广的底物谱；2）Bt_3163对α-pNPG的Km值较传统α-葡萄糖苷酶低两个数量级；3）所有酶均需Ca²⁺激活，暗示金属离子在GH97催化中的保守作用。

结论部分强调，本研究首次阐明GH97家族Group 3酶的独特催化特性，其发现为理解肠道菌群-宿主互作中的碳水化合物代谢网络提供新视角。特别是Bt_3163对合成底物的高效水解能力，在工业生物催化领域具有应用潜力。作者同时指出，未来需通过X射线晶体学解析这些酶的三维结构，以揭示其底物选择性的分子基础。