李属坏死环斑病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立与应用

　　

摘要：

【目的】利用逆转录重组酶介导的核酸等温扩增技术（reverse transcriptase recombinase-aided amplification，RT-RAA）结合CRISPR/Cas12a系统，建立李属坏死环斑病毒（prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）的RT-RAA-CRISPR/ Cas12a可视化检测方法。【方法】依据PNRSV外壳蛋白（coat protein，CP）编码基因的保守序列，设计并筛选扩增效率高、特异性强的引物；针对引物和探针的浓度、扩增体系、反应温度和时间等条件进行优化，建立PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。利用该方法对PNRSV、李痘病毒（plum pox virus，PPV）、苹果花叶病毒（apple mosaic virus，ApMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、马铃薯X病毒（potato virus X，PVX）、马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）等李属植物常见病毒进行检测，验证方法的特异性；将PNRSV的总RNA进行10倍梯度稀释，分别采用RT-PCR、RT-RAA以及RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法进行检测，比较3种方法的灵敏度；对口岸收集的31份疑似感染病毒的桃果实试验样品进行RT-RAA-CRISPR/Cas12a和RT-PCR方法检测，验证该可视化检测方法的实用性。【结果】成功建立了用于检测PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。最终体系优化结果为引物RT-RAA-PNRSV-F2/R2、荧光报告基因FQ、CRISPR-Cas12a、PNRSV-crRNA（CRISPR RNA，crRNA）的工作浓度分别为0.4 μmol·L^-1、800、200、240 nmol·L^-1，反应条件为41 ℃下反应45 min。该方法可特异性检测PNRSV，与李属植物常见病毒无交叉反应。对携带PNRSV的桃果实样品RNA的检测灵敏度，RT-RAA和RT-RAA-CRISPR/Cas12a分别可达3.06 pg·μL^-1和306 fg·μL^-1，RT-RAA-CRISPR/Cas12a灵敏度是RT-RAA和RT-PCR的10倍。口岸收集的31份桃果实试验样品中，RT-PCR检出14份阳性样品，RT-RAA-CRISPR/Cas12a检出15份阳性样品，两者检测结果一致率基本一致。【结论】建立了PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法，该方法具有简便、快速、高灵敏度、高特异性和直观的特点，适用于现场快速检测PNRSV。