小麦氨基酰-tRNA合成酶的重组表达纯化及IRES依赖性多肽合成体系的构建与功能验证

本研究针对植物翻译系统重建的关键瓶颈，成功通过大肠杆菌表达系统制备了16种小麦氨基酰-tRNA合成酶(ARSs)，其中14种具有氨基酰化活性；对难以表达的6种ARSs采用小麦胚芽无细胞翻译系统进行补充，最终构建出包含8种ARSs、延伸因子(eEFs)、释放因子(eRFs)、核糖体及总tRNA的体外翻译体系。该体系首次实现植物源IRES介导的起始因子非依赖性多肽合成，为解析植物蛋白质合成机制及农业生物技术应用提供了重要工具平台。

　　

在合成生物学与农业生物技术领域，植物蛋白质翻译系统的体外重建一直存在重大技术挑战。不同于已成功重构的大肠杆菌和人类翻译系统，植物体系面临两大核心难题：一是氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases, ARSs)的异源表达困难，二是植物特有的多合成酶复合体(multi-synthetase complex, MSC)组装机制不明。这些限制严重阻碍了植物源蛋白的理性设计与高效生产，也制约着抗病作物开发等关键应用。

日本研究团队在《Biochimie》发表的研究中，创新性地采用双管齐下的策略：首先通过大肠杆菌表达系统成功制备16种小麦ARSs（除CysRS、IleRS、LysRS和ThrRS外），其中14种（除ValRS和AsnRS）展现氨基酰化活性；对表达失败的6种ARSs，转而采用小麦胚芽无细胞翻译系统进行制备，最终获得具有功能的ThrRS和ValRS。通过整合8种活性ARSs、真核延伸因子(eukaryotic elongation factors, eEFs)、终止因子(eukaryotic release factors, eRFs)、核糖体及总tRNA，首次构建出功能完备的小麦体外翻译系统。该系统成功实现蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)驱动的起始因子非依赖性翻译，合成含血凝素标签和随机五肽序列的多肽。

关键技术包括：1) 基于小麦基因组数据库的ARSs基因筛选与密码子优化；2) 大肠杆菌低温诱导表达结合多步层析纯化；3) 小麦胚芽无细胞翻译系统的ARSs制备；4) 氨基酰化活性检测体系；5) IRES依赖性翻译效率评估。

【表达与纯化ARSs】
通过生物信息学分析选择六倍体小麦(Triticum aestivum)的ARSs同源序列，16种ARSs在大肠杆菌中可溶性表达并经镍柱亲和层析纯化，其中14种通过酶活验证。未能成功表达的ValRS、AsnRS等6种ARSs转用小麦胚芽无细胞系统表达，最终获得ThrRS和ValRS两种活性酶。

【翻译系统重构】
将纯化的8种ARSs与eEFs、eRFs、核糖体及总tRNA组合，建立的体系可特异性识别IRES序列，在无起始因子条件下完成5kDa多肽合成，证实植物翻译机器核心组分的自组装能力。

【讨论与意义】
研究揭示了植物ARSs的独特性质：部分酶（如IleRS、LysRS）可能依赖未鉴定的共翻译相互作用才能形成活性构象。成功构建的简化版小麦PURE系统为解析植物翻译调控机制提供了模块化工具，其IRES依赖性特征特别适用于研究病毒-植物互作机制。该成果由Haruyuki Furukawa和Hiroyuki Hori团队完成，不仅填补了植物合成生物学技术空白，更为作物抗病基因工程和植物源药用蛋白生产奠定了方法学基础。