SPI1通过转录激活LILRB2抑制TLR8/MyD88/NF-κB通路促进脓毒症中LPS耐受性巨噬细胞的免疫抑制表型

本研究针对脓毒症晚期免疫抑制关键机制，揭示了转录因子SPI1通过上调免疫抑制受体LILRB2，阻断TLR8介导的MyD88/NF-κB信号通路，从而驱动巨噬细胞LPS耐受的新机制。研究人员采用双剂量LPS诱导模型，结合ChIP、Co-IP等技术，首次阐明LILRB2-TLR8互作抑制天然免疫信号的关键作用，为逆转脓毒症免疫麻痹提供新靶点。

　　

脓毒症作为全球公共卫生重大挑战，每年导致约3000万患者死亡，其致命关键在于免疫系统从早期过度炎症反应突然转向晚期免疫麻痹状态。这种"免疫瘫痪"使得患者极易遭受二次感染，而巨噬细胞的LPS耐受现象正是核心环节——当巨噬细胞反复接触细菌毒素LPS后，会像"疲惫的哨兵"般停止释放炎症因子，甚至加速凋亡。尽管已知TLR/NF-κB通路失调与此相关，但具体分子开关始终未明。

清华大学的研究团队在《Biology Direct》发表的重要研究，首次锁定免疫抑制受体LILRB2为调控这一过程的关键分子。通过建立双剂量LPS诱导的巨噬细胞耐受模型，研究人员发现LILRB2在耐受态巨噬细胞中异常高表达。借助染色质免疫沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因等技术，证实转录因子SPI1像"基因开关"般直接结合LILRB2启动子区域；而免疫共沉淀(Co-IP)实验则捕捉到LILRB2与TLR8的物理结合，这种相互作用阻断了MyD88/NF-κB信号传导，就像给免疫响应的"发动机"踩下刹车。该研究不仅揭示脓毒症免疫抑制的新机制，更发现SPI1-LILRB2-TLR8轴可作为逆转免疫麻痹的治疗靶点。

关键技术方法包括：采用PMA诱导THP-1细胞和GM-CSF培养外周血单核细胞(PBMCs)分化为巨噬细胞；建立单次/序贯LPS刺激模型模拟正常应答与耐受状态；通过shRNA敲低和过表达载体调控基因表达；运用流式细胞术检测凋亡与极化标志物(CD86/CD206)；ELISA和RT-qPCR定量炎症因子；Co-IP验证蛋白互作；ChIP与双荧光素酶报告基因分析转录调控；核质分离评估p65核转位。

【LPS耐受巨噬细胞转化为免疫抑制表型，伴随LILRB2表达升高】
通过梯度浓度LPS筛选确定10 ng/mL为最佳诱导浓度。序贯LPS刺激显著抑制细胞活力(CCK-8检测降低23.6%)，促进凋亡(流式检测增加2.1倍)，同时使TNF-α等促炎因子分泌减少68%-82%。M1标志物CD86/CD206比值下降4.3倍，而LILRB2在mRNA和蛋白水平分别上调5.7倍和3.9倍，提示其可能作为免疫抑制"刹车分子"。

【敲低LILRB2抑制LPS耐受巨噬细胞的免疫抑制表型】
构建三种sh-LILRB2稳转株(其中sh-LILRB2-2敲低效率达81%)。基因沉默后，耐受巨噬细胞活力恢复至对照组的89%，凋亡率降低41%，TNF-α分泌增加2.3倍，CD86⁺细胞比例回升至35.7%。Western blot显示p-p65/p65比值提升2.8倍，证实LILRB2缺失可重新"点燃"NF-κB信号。

【LILRB2通过结合TLR8抑制MyD88/NF-κB信号】
STRING数据库预测LILRB2与TLR8存在相互作用，Co-IP实验验证其在耐受状态下结合增强3.4倍。关键的是，LPS耐受使MyD88、p-TAK1等通路蛋白表达降低52-65%，p65核转位减少72%。而LILRB2敲除使这些蛋白恢复至近正常水平，如同解除TLR8的"分子枷锁"。

【SPI1通过转录激活上调LILRB2】
生物信息学预测SPI1是LILRB2唯一潜在转录因子。实验显示LPS耐受使SPI1表达升高4.2倍。通过ChIP证实SPI1直接结合LILRB2启动子-312至-304位点，双荧光素酶报告基因显示突变该位点使启动子活性降低83%。当用sh-SPI1-1(敲低效率79%)干预后，LILRB2表达下降71%，证实存在SPI1→LILRB2的转录级联。

这项研究创新性地描绘出"SPI1-LILRB2-TLR8"调控轴：在脓毒症晚期，高表达的SPI1像"主控开关"激活LILRB2转录，后者通过物理结合TLR8阻断MyD88/NF-κB通路，最终导致巨噬细胞陷入免疫麻痹状态。该发现不仅解释临床观察到的免疫功能障碍机制，更提供三个潜在干预节点——针对SPI1的转录抑制剂、LILRB2阻断抗体或TLR8激动剂，为开发"免疫再激活"疗法奠定理论基础。值得注意的是，LILRB2作为免疫检查点分子，其调控机制可能与其他免疫抑制通路(如PD-1/CTLA-4)存在交叉对话，这为后续联合治疗研究指明方向。