大肠杆菌DNA聚合酶I在体内外对引物-模板连接区错配的校对机制研究

本研究针对DNA复制过程中引物-模板连接区错配的校对机制展开探索，通过非抑制性体外校对实验和MALDI-TOF MS分析，揭示了大肠杆菌DNA聚合酶I（Pol I）可有效校正3'端1-4核苷酸（nt）范围内的错配，并提出"回溯移动"的分布性校对模型。体内实验进一步验证该机制对基因组稳定性的维护意义，为理解DNA复制保真性提供了新视角。

　　

DNA复制是生命遗传信息传递的核心过程，其保真性直接影响物种的生存与进化。尽管DNA聚合酶具有惊人的精确性，但每10⁴-10⁵次核苷酸插入仍会出现错误配对。这种"分子打字错误"若未被及时修正，将导致突变积累甚至引发癌症等疾病。在进化长河中，生物体发展出多重保障机制，其中DNA聚合酶固有的3'-5'外切酶校对功能(proofreading)堪称第一道防线。然而长期以来，科学界对校对作用的有效作用范围存在争议——它究竟只能修剪最末端的错配核苷酸，还是能深入"掘进"引物内部进行修正？

台北的研究团队在《DNA Repair》发表的研究中，以大肠杆菌DNA聚合酶I（Pol I）为模型，通过创新性的实验设计揭开了这一谜题。研究采用非抑制性体外实验结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术，首次精确绘制出Pol I的校对作用图谱。令人惊讶的是，这种酶不仅能处理3'端第1位的错配，对第2-4位的"深埋"错配也展现修正能力。更突破性的是，通过设计含双重错配的DNA底物，研究者发现Pol I会通过"分布性回溯"沿模板逆向移动，像校对员逐字检查文稿般分段修正内部错配。这种非持续性的反应机制，完全颠覆了传统认为校对必须连续进行的认知。

关键技术包括：1）非抑制性体外校对实验系统避免ddNTPs干扰；2）MALDI-TOF MS精确分析产物；3）双错配底物设计验证回溯机制；4）噬菌粒切口C-C底物体内验证系统。

材料与方法
研究采用28-mer模板与21-mer引物构建系列单/双错配底物，通过控制dNTPs浓度确保非抑制条件。体外实验使用Klenow片段(KF)，体内实验采用phagemid转化大肠杆菌，通过抗生素抗性筛选量化校对效率。

结果

1. 单错配校正范围：Pol I可完全修正3'端1-2 nt错配，对3-4 nt错配呈现部分修正能力，超过此范围则无活性。
2. 双错配验证回溯机制：当两个错分别位于3'端1-4 nt和更上游时，酶通过分步回溯先后修正两处错误，证实其分布性工作模式。
3. 时间进程分析：内部错配修正呈现非持续性反应特征，支持分步校对假说。
4. 体内验证：噬菌粒切口底物转化实验显示，4 nt内的错配修正效率与体外数据高度一致。

讨论
该研究首次系统阐明Pol I校对作用的空间限制与工作机制。发现的"3-4 nt校对窗口"为理解DNA复制保真性提供了量化标准，而"分布性回溯"模型则解释了酶如何协调聚合与校对活性的结构基础。特别值得注意的是，该机制可能普遍存在于Pol A家族酶中，如研究中对比的T7、Bst Pol I等。在医学应用层面，这些发现为开发靶向DNA聚合酶的抗癌药物提供了新思路——通过干扰特定位置的校对功能，可人为增加癌细胞的突变负荷。

研究还揭示了J-helix区域在监测引物-模板匹配中的关键作用，该结构域通过小沟接触感知双链几何畸变，这或是触发回溯的分子开关。未来研究可聚焦于该区域的工程化改造，有望开发出超高保真度的合成生物学工具酶。

这项工作的双重验证策略（体外纯化酶体系+体内转化系统）为核酸酶功能研究树立了新范式。正如作者指出，校对功能与内切酶V修复通路的协同作用，暗示细胞可能利用类似机制处理其他类型的DNA损伤。这些发现将推动对基因组稳定性维持机制的重新认识。