基于p26-gp90融合蛋白的胶体金免疫层析试纸条开发用于马传染性贫血病毒抗体的快速检测

本研究针对马传染性贫血病毒(EIAV)缺乏快速现场诊断工具的难题，开发了一种基于p26-gp90融合蛋白的胶体金免疫层析试纸条(ICLF)。该技术通过优化抗原设计显著提升了检测灵敏度（可识别1/200稀释阳性血清），且与非洲马瘟病毒(AHSV-2)等常见马属病原体无交叉反应，临床样本验证显示与cELISA方法一致性达91.41%，为EIAV防控提供了便携高效的解决方案。

　　

马传染性贫血病毒(EIAV)是全球马属动物面临的重大健康威胁，这种通过蚊虫叮咬和血液接触传播的逆转录病毒，能导致发热、贫血甚至死亡。尽管世界动物卫生组织(OIE)将之列为必须通报的11种马病之一，但现有诊断方法存在明显局限：传统琼脂扩散试验(AGID)需24小时且灵敏度低，而ELISA虽灵敏度提高却依赖专业设备。更棘手的是，病毒结构蛋白p26虽保守但存在变异，单独使用可能漏检。这些诊断瓶颈使得疫情早期防控困难，亟需开发兼具高敏、特异和便携的新型检测技术。

为突破这一技术壁垒，山西农业大学等机构的研究人员创新性地将病毒保守的p26蛋白与高免疫原性的gp90蛋白融合，构建了p26-gp90重组抗原。通过原核表达系统获得70kDa融合蛋白后，将其应用于胶体金免疫层析试纸条(ICLF)开发。研究团队采用双抗原夹心法设计试纸条，在硝酸纤维素膜上分别包被p26-gp90（检测线T）和羊抗鼠IgG（质控线C），胶体金标记的融合蛋白作为示踪物。该研究使用194份临床马血清样本（来自杭州桐庐马术中心）进行验证，并与OIE推荐的竞争ELISA(cELISA)进行比对。论文最终发表于《Virology Journal》。

关键技术方法包括：1）p26-gp90融合基因设计（基于NCBI序列ABE03841和AAC24024）；2）原核表达与镍柱纯化（使用8M尿素溶解包涵体）；3）胶体金标记（氯金酸还原法制备40nm颗粒）；4）试纸条组装（样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸的层压工艺）；5）性能评估（干扰物质测试含EDTA-K₂等14种因素）。

表达、纯化和Western Blot分析p26-gp90融合蛋白
SDS-PAGE证实成功获得70kDa目标蛋白（图2）。通过8M尿素溶解包涵体并经镍柱纯化，最终产物纯度满足免疫检测需求。该融合蛋白兼具p26的保守性和gp90的高免疫原性，为后续试纸条开发奠定基础。

EIAV抗体ICLF试纸条的特异性
试纸条在非洲马瘟病毒(AHSV-2)、马动脉炎病毒(EAV)等常见马属病原体检测中均无交叉反应（图3）。针对血浆中EDTA-K₂、肝素等14种干扰物质的测试显示，50ng/mL浓度下未出现假阳性，证实其优异特异性。

灵敏度与稳定性
试纸条可检出AGID灵敏度1/8稀释阳性血清的1/200稀释样本（图5），灵敏度提升25倍。加速稳定性试验显示，2-8℃保存27个月后仍能有效检测，30±3℃环境下性能未显著衰减，满足现场应用需求。

研究结论表明，这种基于双抗原设计的ICLF试纸条实现了三大突破：1）检测时间从AGID的24小时缩短至10分钟；2）灵敏度显著高于OIE金标准；3）无需专业设备即可完成现场检测。临床验证显示其与cELISA的符合率达91.41%（敏感性90.43%，特异性100%），尤其适合牧场、口岸等场景的快速筛查。

该研究的创新价值在于：首次将p26-gp90融合策略应用于EIAV诊断，既克服了单独使用p26可能漏检变异毒株的风险，又通过胶体金技术实现了高敏便携检测。作者在讨论中指出，该方法成本仅为ELISA的1/5，且操作人员无需专业培训，有望成为AGID的理想替代方案。未来若将试纸条与智能手机图像分析结合，可进一步实现检测结果的数字化判读，为全球EIAV防控提供中国智慧。