基于线扫描光片结构照明显微镜(LiL-SIM)实现深层生物组织超分辨成像的简易升级方案

针对深层生物组织成像中光学像差与散射导致的超分辨难题，Patrick Byers团队开发了一种低成本改造方案，通过在线扫描双光子显微镜中集成柱面镜、场旋转器和sCMOS相机，实现了线扫描光片结构照明显微镜(LiL-SIM)技术。该技术将分辨率提升近2倍(达150 nm)，在70μm深度的鼠心肌组织中仍保持超分辨能力，为活体深层组织观测提供了简易高效的解决方案。

　　

在生命科学研究中，观测亚细胞结构如同用望远镜探索宇宙的奥秘。传统光学显微镜受限于阿贝衍射极限，分辨率被禁锢在200纳米以上，而超分辨显微术(SRM)的诞生打破了这一桎梏。然而当科学家们将目光转向活体组织的深层结构时，新的挑战接踵而至——生物组织就像毛玻璃，光线在其中经历复杂的散射和像差，使得超分辨信号如同雾里看花。特别是结构化照明显微术(SIM)这类依赖干涉图案的技术，其调制对比度在组织深处急剧衰减，导致现有方案在15μm深度就难以为继。

来自德国比勒菲尔德大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表创新成果，提出了一种名为"光片线扫描结构照明显微镜"(LiL-SIM)的技术方案。该研究巧妙地融合双光子激发的穿透优势与sCMOS相机的光片快门模式(LSS)，仅通过添加柱面镜、多夫棱镜等廉价光学元件，就将普通双光子显微镜升级为深层组织超分辨系统。这种改造方案成本不足传统设备的十分之一，却能在70μm深度的鼠心肌组织中实现150纳米分辨率，为神经科学、发育生物学等领域提供了突破性的观测工具。

研究团队采用三项关键技术：1)利用压电旋转台控制的多夫棱镜-半波片组合实现精确的场旋转，支持多角度图案采集；2)采用逐步线扫描替代传统干涉图案生成，兼容sCMOS的LSS模式；3)结合双光子激发(800 nm波长)的非线性光学效应，提升深层组织的信号特异性。实验样本涵盖荧光微球(190 nm)、辐射松树脂道、斑马鱼胚胎和转基因鼠心肌组织，通过傅里叶环相关性(FRC)和去相关分析定量评估分辨率。

<结果部分>

光片线扫描SIM的概念与分辨率提升

研究团队通过将高斯光束转换为线聚焦，配合多夫棱镜的2α旋转机制（30°机械旋转产生60°光学旋转），构建了可编程的线扫描照明系统。使用190 nm荧光微球验证显示，传统双光子成像(LiL-2PM)分辨率为275 nm，经SIM重建后降至189-196 nm，与微球物理尺寸完美吻合。线对测试表明分辨率从270 nm提升至150 nm，接近理论极限的1.94倍提升。

光片快门模式延长穿透深度

比较滚动快门(RS)与LSS模式发现，在40μm深度的斑马鱼样本中，LSS将调制对比度从0.07提升至0.2。傅里叶变换分析证实，LSS模式通过抑制相邻扫描线的散射荧光，使超分辨重建的可用深度延伸至56μm，而RS模式在2μm深度就已失效。

深层生物组织的超分辨成像

在辐射松树脂道样本中，LiL-SIM在30μm深度仍能清晰分辨细胞壁的纳米级结构（299±14 nm→156±12 nm）。鼠心肌组织实验更创下70μm的观测纪录，成功解析肌动蛋白纤维间距（146 nm）和横纹特征。值得注意的是，虽然120μm深度仍能获得光学切片，但60μm后出现的像差提示这是当前技术的极限深度。

这项研究开创性地解决了超分辨显微术在深层组织应用中的关键瓶颈。通过将双光子激发的光学切片能力、线扫描的空间编码优势与LSS模式的背景抑制特性相结合，LiL-SIM实现了"鱼与熊掌兼得"的效果——既保持传统SIM的2倍分辨率提升，又突破其穿透深度限制。技术上的三大创新点（场旋转补偿、逐步线扫描、LSS同步）为显微镜改造提供了标准化方案，使得普通实验室也能以低廉成本实现深层超分辨成像。尽管存在成像速度受限（当前帧率4.4 Hz）和荧光标记要求严格等局限，但该技术已为神经突触、肿瘤微环境等深层组织研究打开新窗口。未来通过K镜替代多夫棱镜、平顶光束优化等措施，有望进一步扩大视野和提升性能。