固定化柠檬明串珠菌ABK-1交替蔗糖酶提升稳定性和转糖基效率的研究

本研究针对交替蔗糖酶(ALT)稳定性差、工业应用受限的问题，通过将柠檬明串珠菌ABK-1来源的ALT固定于戊二醛活化壳聚糖微珠，优化后获得活性回收率59.7%、固定化活性10.3 U/g的制剂。固定化ALT展现出更宽pH适应范围(pH 5-6)、37℃下半衰期提升5.4倍，且重复使用14次后仍保留50%活性，其转糖基效率增强可合成更多异麦芽糖/三糖，为工业化生产交替聚糖(GOSs)提供新策略。

　　

交替蔗糖酶(Alternansucrase, ALT)作为糖苷水解酶家族的重要成员，能催化蔗糖合成具有交替α-1,3和α-1,6糖苷键的交替聚糖(alternan)，这种特殊结构的葡聚糖在药物递送、功能性食品和益生元开发中展现出巨大潜力。然而天然ALT存在表达量低、热稳定性差、难以重复利用等瓶颈，严重制约其工业化应用。虽然已有研究通过蛋白质工程改造提升酶稳定性，但固定化技术因其兼具增强稳定性和实现酶循环利用的双重优势，成为更具产业化前景的解决方案。

针对这一挑战，来自朱拉隆功大学和艺术大学的研究团队在《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》发表论文，首次报道了柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum) ABK-1来源ALT的固定化研究。研究人员采用戊二醛(glutaraldehyde)活化壳聚糖(chitosan)微珠作为载体，通过系统优化交联浓度和酶负载量等参数，成功制备出高活性固定化酶，并深入探究了其生化特性改变与工业应用潜力。

研究主要运用了以下关键技术：1) 重组ALT在大肠杆菌BL21(DE3)中的低温诱导表达与DEAE离子交换纯化；2) 动态光散射(DLS)分析酶产物粒径分布；3) 高效液相色谱(HPLC)定量检测转糖基产物；4) 响应面法优化固定化条件。

表达和纯化重组ALT
通过pETD7载体在E. coli BL21(DE3)中表达截短型alt基因，经DEAE阴离子交换层析获得比活性18.7 U/mg的部分纯化酶，SDS-PAGE验证纯度满足固定化要求。

ALT在壳聚糖微珠上的固定化
研究发现2.5%戊二醛浓度和10 mg/g酶负载量可实现最佳固定化效果，活性回收率达59.7%，固定化活性为10.3 U/g。扫描电镜显示固定化微珠表面形成致密交联网络，这种多孔结构有利于底物扩散。

生化特性表征
固定化使ALT最适pH从4.0偏移至5-6，且在pH 3-8范围内保持更高残余活性。热稳定性显著提升，37℃下半衰期从游离酶的15.2小时延长至82.3小时(提升5.4倍)，50℃处理1小时后仍保留60%活性，而游离酶完全失活。

转糖基效率分析
DLS检测显示固定化ALT产生的交替聚糖平均粒径达117.3 nm，显著大于游离酶的79.75 nm，表明固定化增强了聚合效率。HPLC证实固定化酶合成异麦芽糖(isomaltose)和异麦芽三糖(isomaltotriose)的产量分别提高1.3和1.5倍。

操作稳定性评估
固定化ALT在14次重复使用后仍保留50%初始活性，4℃储存28天后活性保持82%，远优于游离酶的完全失活，证实其优异的可重复利用性和储存稳定性。

该研究首次证实固定化不仅能显著提升ALT的稳定性，还可增强其转糖基效率，这归因于：1) 戊二醛交联产生的多点附着限制了酶构象波动；2) 壳聚糖载体提供的微环境优化了酶-底物相互作用；3) 固定化可能诱导ALT形成更有利于糖链延伸的活性构象。研究成果为交替聚糖的规模化生产提供了可靠技术方案，同时为其他糖基转移酶的固定化策略设计提供了重要参考。特别值得注意的是，固定化ALT合成的较大粒径交替聚糖可能在药物缓释载体构建中具有独特优势，而其增强的GOSs产率则有利于功能性益生元的开发，这些发现将推动交替聚糖在生物医药和食品工业中的应用进程。