中国东北边境城市活禽市场猪圆环病毒2型和3型的流行与基因变异研究

本研究首次揭示中国东北六座边境城市活禽市场中猪圆环病毒（PCV2/PCV3）的跨境传播风险。通过qPCR检测132份样本，发现PCV2在猪肉（75.0%）、砧板（73.9%）和地面（64.3%）广泛存在，PCV3在砧板检出率高达67.4%。基因测序证实PCV2存在2a/2b/2d三种亚型，其中丹东株与俄罗斯毒株同源性达99.4%；PCV3均为3a亚型，珲春株与长春猪场毒株同源性99.6%，凸显边境活禽贸易对病毒跨区域传播的推动作用。

　　

引言

猪圆环病毒2型（PCV2）和3型（PCV3）是圆环病毒科的单链环状DNA病毒。PCV2自1991年在加拿大首次发现以来已成全球猪业重要病原，导致断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）等疾病，造成重大经济损失。其高突变率驱动了基因组多样化，目前分为8种基因型（2a-2h），其中2d型已成为中国主流毒株。2016年在美国发现的PCV3随后在中国、韩国、俄罗斯等国家检出，与繁殖障碍和多系统炎症相关，其基因分型尚存争议，专家共识暂分为3a和3b型。

边境城市和养殖场是动物传染病跨境传播的关键节点。中国东北边境地区因免签政策导致频繁跨境活动，加之活畜走私风险，使活禽市场成为病原监测的理想场所。本研究聚焦丹东、集安、珲春、密山、抚远、黑河六座中俄/中朝边境城市，首次系统评估活禽市场中PCV2/PCV3的污染水平及跨境传播风险。

材料与方法

2.1 样本采集

2023年7月从六市活禽市场46个肉摊采集三类样本：猪肉（n=44）、砧板拭子（n=46）、地面拭子（n=42）。采用两阶段抽样法：通过电商平台"大众点评"筛选各市最大活禽市场，依据规模、客流量和地理可达性选择代表性市场。对肉摊采用便利抽样法，每摊采集三类样本。样本经独立包装冰运至南京农业大学兽医诊断实验室。

2.2 DNA提取

猪肉样本经PBS稀释后机械粉碎，冻融离心取上清液；环境拭子经PBS浸泡取洗脱液。使用Vazyme DNA/RNA提取试剂盒按说明书操作提取核酸。

2.3 TaqMan qPCR检测

采用已验证的探针法检测PCV2/PCV3。PCV2反应体系含特异性引物（PCV2-qF/qR）和VIC标记探针；PCV3体系含PCV3-qF/qR和FAM标记探针。以构建的重组质粒（pEASY-PCV2/pCC1-4k-PCV3）为阳性对照，设定Ct<37为阳性阈值。扩增程序：PCV2为95°C 30秒，95°C 5秒→60°C 30秒×40循环；PCV3为95°C 7分钟，96°C 10秒→60°C 30秒×45循环。

2.4 常规PCR与测序

使用四对引物扩增PCV2/PCV3全基因组。反应条件：95°C 5分钟；95°C 30秒→55°C 15秒→72°C 30秒×40循环；72°C 5分钟延伸。胶回收纯化产物送测序，经SeqMan拼接基因序列。

2.5 系统进化与统计分析

通过ClustalW比对获得及参考序列（补充材料表S2），用MEGA X软件以最大似然法（1000次重复）构建ORF2基因系统进化树。采用逻辑回归比较检出率差异，Kruskal-Wallis检验分析Ct值分布，显著性阈值p<0.05。

结果

3.1 qPCR检测结果

PCV2在猪肉、砧板、地面的检出率分别为75.0%（95% CI: 59.7-86.8%）、73.9%（58.9-85.7%）、64.3%（48.0-78.4%），三类样本间无显著差异（p>0.05）。PCV3检出率依次为砧板67.4%（52.0-80.5%）、地面54.7%（38.7-70.2%）、猪肉31.8%（18.6-47.6%），其中猪肉检出率显著低于砧板（p=0.001）。样本类型对PCV2/PCV3阳性样本Ct值分布均无显著影响（p>0.05），但Ct值分布特征显示：PCV2阳性猪肉样本Ct值分布广泛，地面样本变异较小；PCV3地面样本出现极端离群值。

地域分析显示，黑河市PCV2/PCV3检出率最高（85.2%/70.4%），其他城市分布见热图（图2）。

3.2 PCV2 ORF2基因分析

成功从猪肉样本获得五条PCV2 ORF2序列（砧板/地面样本未能扩增）。系统进化显示：珲春株（HC3/HC7）、丹东株（DD3）属2d型；丹东株（DD2）为2b型；抚远株（FY2）为2a型（图3）。同源性分析显示：

• 核苷酸相似性83.8-97.3%，DD3与HC3相似度最高（97.3%）
• 氨基酸相似性78.2-97.9%
• DD3与俄罗斯株MZ511702同源性99.4%
• DD2与河南株KX831482同源性99.4%
• FY2与河北株KY940532同源性98.1%

3.3 PCV3 ORF2基因分析

五条PCV3 ORF2序列均来自猪肉样本（登录号PQ684443-47）。系统进化表明所有毒株均属3a基因型（图5），核苷酸相似性>98%（HC3与HC6达99.2%）。珲春株（HC3/HC6）与吉林猪场毒株（MH277112/113）及韩国株（KY996341.1/343.1）同源性>99.6%。

讨论

本研究首次揭示东北边境活禽市场存在PCV2/PCV3跨境传播的分子证据：

1. 环境传播风险：砧板成为关键污染节点，PCV3检出率（67.4%）显著高于猪肉（31.8%），可能与肉类加工过程中病毒富集及木质多孔结构存留病原体相关
2. 基因多样性：PCV2存在2a/2b/2d三种亚型，反映病毒多源性输入
3. 跨境传播证据：
   • 丹东PCV2毒株（DD3）与俄罗斯株同源性99.4%
   • 珲春PCV3毒株与长春猪场及韩国株高度同源
4. 监测价值：边境活禽市场可发挥哨点监测作用，为跨境传播提供早期预警

需关注氨基酸突变位点：PCV2 DD2/FY2株在衣壳蛋白130/133位点突变（B细胞表位区），PCV3黑河株在203/204位点突变（预测B细胞表位区），这些变异可能影响病毒抗原性。

局限性与展望

样本量限制（n=132）和横断面设计难以反映季节动态。建议未来开展：

1. 供应链溯源研究（养殖场→运输→市场）
2. 病毒存活周期实验（砧板等环境介质）
3. 扩大边境城市监测网络

结论

东北边境活禽市场存在PCV2/PCV3广泛污染，砧板是重要传播媒介。检测到与俄罗斯、韩国高度同源的毒株，证实猪肉贸易促进病毒跨境扩散。建议将边境市场纳入国家动物疫病监测体系，强化生物安全措施以阻断新兴猪病传播链。