Gp21作为长头乳球菌噬菌体94p4新型SF4解旋酶的结构与功能解析及其在DNA复制中的作用

本研究针对乳球菌噬菌体Ceduovirus复制机制中关键蛋白功能未知的问题，通过生物信息学预测与生化实验验证，首次鉴定出早期基因产物Gp21为超家族4（SF4）解旋酶。研究发现Gp21以六聚体形式依赖ATP/Mg2+在5′→3′方向解旋DNA，其保守基序突变会破坏解旋活性和寡聚化。该成果填补了乳球菌噬菌体SF4解旋酶的功能空白，为理解噬菌体复制机制提供新视角。

　　

在乳制品工业中，乳球菌噬菌体的爆发常导致发酵失败，造成巨大经济损失。其中长头噬菌体Ceduovirus是乳球菌的主要侵染者，但其DNA复制机制仍存在诸多谜团。尽管前期研究发现这类噬菌体依赖宿主启动蛋白进行复制起始，但其早期基因区域编码的蛋白功能大多未被实验验证。尤其令人困惑的是，基因组分析预测其早期基因产物可能参与复制，但缺乏直接证据。

为解决这一科学问题，来自某研究所的Anna Santo团队对乳球菌噬菌体94p4的Gp21蛋白展开系统研究。通过整合计算生物学与分子生物学方法，首次证实Gp21是功能性SF4解旋酶，相关成果发表在《International Journal of Biological Macromolecules》。

研究采用多学科交叉策略：通过AlphaFold3建模预测Gp21三维结构；利用电泳迁移率实验（EMSA）分析DNA结合特性；建立体外解旋实验系统评估方向特异性；结合位点定向突变和圆二色谱（CD）验证关键氨基酸功能；采用尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）解析寡聚状态。

研究结果揭示：
3.1 In silico鉴定Gp21同源物
生物信息学分析显示Gp21具有SF4解旋酶特征性基序（H1-H4），其结构模型与T7噬菌体Gp4和RSF1010质粒RepA高度相似。二维聚类分析表明Gp21形成独立于典型DnaB样解旋酶的进化分支。

3.2 Gp21的DNA结合活性
EMSA实验证明Gp21优先结合单链DNA（ssDNA）和分叉结构，对30duplex5′的亲和力最强（K_d=0.32 μM）。ATPγS存在时结合减弱，提示ATP水解调控结合动态。

3.3 Gp21的解旋酶活性
3.3.1 辅因子依赖性
解旋活性严格依赖ATP/Mg²⁺（最佳比例1:1），其他NTP/dNTP效率显著降低。ATPγS完全抑制活性，证实能量需求。

3.3.2 方向特异性
仅能解旋5′突出结构（asym5′），对3′突出无活性，明确其5′→3′方向性。分叉底物30duplex5′解旋效率最高（EC₅₀=0.20 μM）。

3.3.3 底物偏好性
延长双链区（53duplex5′）使效率降低66%，表明Gp21适合处理短双链区。

3.4 六聚体形成
SEC-MALS显示天然Gp21主要形成六聚体（234 kDa），活性实验证实仅六聚体具有解旋能力。

3.5 突变体功能分析
H1基序K48A突变保留六聚化但丧失解旋活性；H1a/H2/H3基序突变（E81A/D135A/H177A）破坏寡聚化，证实这些残基对结构和功能至关重要。

该研究首次实验证实Ceduovirus噬菌体编码功能性SF4解旋酶，突破性地解决了早期基因产物功能不明的难题。Gp21通过保守基序协调ATP水解与六聚体组装，以典型5′→3′方向解旋DNA的特性，暗示其在噬菌体复制从θ模式向起始子非依赖模式转换中的关键作用。这不仅完善了乳球菌噬菌体复制模型，其独特的进化地位（介于质粒RepA与噬菌体解旋酶之间）更为研究DNA解旋酶的分子进化提供新线索。未来针对Gp21与宿主复制机器互作的研究，可能为开发抗噬菌体策略开辟新途径。