远缘杂交砧木通过激活接穗品种转录因子促进核桃生长与产量的分子机制

本研究揭示了核桃(Juglans regia)远缘杂交砧木"中宁奇"（'Zhongningqi'）通过调控miR396a-JrGRF4b/JrGIF1a-JrGATA4信号级联通路，显著增强接穗品种"上松14号"（'Shangsong14'）生长势与产量的分子机制。15年田间试验证实，异源嫁接(S14/Q)较自嫁接(S14/S14)显著提升树高、冠幅及坚果产量，其核心机制在于砧木诱导接穗中miR396a表达下调，释放JrGRF4b转录因子活性，进而激活JrGATA4及其下游细胞周期基因JrCycD4;1/JrCycJ18的表达，促进形成层细胞增殖。该研究为木本植物砧穗互作育种提供了新靶点。

　　

异源嫁接诱导核桃接穗木材和坚果产量提升
连续15年田间观测显示，以远缘杂交砧木"中宁奇"（Q，Juglans hindsii × J. regia）为根砧、栽培品种"上松14号"（S14）为接穗的异源嫁接组合(S14/Q)，较自嫁接(S14/S14)表现出显著生长优势。嫁接部位直径、树高、冠幅等营养生长指标提升30-50%，单株坚果产量增加40%以上。解剖学分析发现S14/Q接穗形成层细胞层数增加2.1倍，细胞面积扩大1.8倍，光合速率(P_n)提升25%，这些变化与产量性状呈显著正相关。

转录因子JrGRF4b/JrGIF1a调控嫁接核桃接穗活力
RNA-seq分析鉴定出91个嫁接响应差异基因，其中生长调控因子JrGRF4b和其互作蛋白JrGIF1a在S14/Q中表达量较S14/S14上调4.7倍。酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)实验证实，JrGRF4b通过QLQ结构域与JrGIF1a的SNH结构域形成功能复合体。系统发育分析显示，JrGRF4b与白桦(Betula platyphylla) BpGRF4b同源性达89%，暗示其在木本植物中功能保守。

miR396a-JrGRF4b模块的剂量效应
砧木Q中miR396a成熟体含量仅为接穗S14的35%，导致S14/Q接穗中miR396a表达较S14/S14下降60%。3' RACE和双荧光素酶报告系统证实，miR396a通过切割JrGRF4b mRNA的第10位核苷酸(7/13配对)负调控其表达。当引入7个核苷酸突变构建抗miRNA的rJrGRF4b时，荧光素酶活性恢复至对照水平。

转基因白桦验证遗传模块功能
鉴于核桃遗传转化困难，研究选用白桦进行异源验证。过表达rJrGRF4b和JrGIF1a的株系在14月龄时株高增加55%，茎基部直径增加40%，形成层细胞增殖显著；而miR396a过表达株系则表现矮化表型。叶片气孔导度(Cond)和胞间CO₂浓度(C_i)变化与核桃嫁接表型一致，证实该调控网络的跨物种保守性。

JrGRF4b-JrGATA4级联通路激活细胞周期
酵母单杂交(Y1H)和电泳迁移率变动分析(EMSA)显示，JrGRF4b直接结合JrGATA4启动子-876bp处的"GGGCGG" motif，激活其转录。在S14/Q中，JrGATA4表达量提升3.2倍，其下游细胞周期基因JrCycD4;1和JrCycJ18分别上调4.1倍和3.8倍。这与哺乳动物中GATA4调控cyclin D1促进细胞增殖的机制类似，首次在植物中发现GATA转录因子参与砧穗互作调控。

该研究阐明了一条从砧木到接穗的miRNA-转录因子-细胞周期基因的级联调控通路，为多年生木本植物嫁接改良提供了分子育种靶点。未来可通过基因组编辑技术修饰砧木miR396a表达，实现非转基因接穗的产量提升，具有重要应用前景。