双抗体夹心ELISA检测猪流行性腹泻病毒N蛋白的建立及其在高效诊断中的应用

为解决猪流行性腹泻病毒(PEDV)高传染性与致死率导致的养猪业经济损失问题，研究人员通过HEK-293i细胞表达重组N蛋白制备单克隆抗体(4F2/2G4)，开发出高灵敏度(0.05 ng/mL)和特异性(无PRV/PRRSV/ASFV/PCV2交叉反应)的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)，为PEDV检测提供可靠工具。该成果发表于《Journal of Microbiological Methods》。

　　

猪流行性腹泻病毒(PEDV)近年来对全球养猪业造成毁灭性打击，其高传染性特征可使新生仔猪死亡率达100%，仅美国2013年疫情就导致约700万头仔猪死亡。传统检测方法如RT-PCR耗时较长，而胶体金试纸条灵敏度不足，这使得开发新型诊断工具成为行业迫切需求。

中国农业科学院某研究团队在《Journal of Microbiological Methods》发表的研究中，创新性地采用HEK-293i真核表达系统制备重组N蛋白，通过杂交瘤技术获得两株高性能单抗4F2和2G4。功能验证显示：4F2能识别N端保守线性表位，2G4则靶向C端高度保守的"SGKNTPKKNKSRATSKE"序列，二者均适用于免疫荧光(IFA)和Western blot。基于此建立的DAS-ELISA检测体系，灵敏度较常规方法提升20倍，最低可检出0.05 ng/mL重组蛋白或10^2.59 TCID₅₀/mL病毒滴度，且与猪圆环病毒2型(PCV2)等常见病原无交叉反应。

关键技术包括：1) HEK-293i真核表达重组N蛋白；2) BALB/c小鼠免疫制备单抗；3) 线性表位肽扫描定位抗体结合域；4) 棋盘滴定法优化DAS-ELISA反应体系。研究特别从江苏某爆发猪场采集的12份腹泻样本中成功检出PEDV，验证了方法的实用性。

主要研究发现：

1. 抗体特性分析：4F2的EC₅₀为0.78 μg/mL，2G4达0.15 μg/mL，后者对天然病毒结合力更强。
2. 表位保守性验证：2G4识别的C端表位在G1/G2基因型毒株中完全保守，解释了其广谱反应性。
3. 诊断性能评估：与商品化RT-PCR试剂盒对比显示，该方法符合率达98.6%，且检测时间缩短至90分钟。

该研究不仅提供了首个基于N蛋白双表位检测的PEDV诊断方案，其揭示的保守表位更为亚单位疫苗设计提供了新靶点。研究者特别指出，该方法可直接检测粪便样本，对实现猪场PEDV的早期预警具有重要价值，预计可减少因误诊导致的年经济损失超2亿元。未来研究将探索该技术在其他冠状病毒检测中的适用性。