酵母过氧化物酶体从头合成紫杉叶素的代谢工程策略及机制研究

本研究针对植物提取紫杉叶素(taxifolin)效率低下的产业难题，创新性地在酿酒酵母过氧化物酶体中重构了完整的紫杉叶素合成通路。通过优化前体供应、限速酶表达及辅因子再生系统，首次实现了过氧化物酶体区室化合成紫杉叶素，摇瓶发酵产量达120.3±2.4 mg/L，为高附加值黄酮类化合物的微生物合成提供了新范式。

　　

紫杉叶素(taxifolin)作为一种具有强抗氧化活性的二氢黄酮醇，在食品、医药和农业领域具有重要应用价值。然而，传统从落叶松根部提取的方法存在原料稀缺、工艺复杂等问题，提取率仅0.8-1.2%。虽然微生物合成提供了新思路，但现有研究多局限于细胞质表达系统，未能充分利用真核细胞的区室化优势。酵母过氧化物酶体因其独特的β-氧化代谢产生丰富乙酰辅酶A(acetyl-CoA)的特性，已成为萜类和脂肪酸衍生物合成的理想场所，但其在黄酮类化合物合成中的应用尚未探索。

上海大学医学院等机构的研究人员创新性地将紫杉叶素合成途径定位于酿酒酵母过氧化物酶体。研究采用模块化工程策略：首先验证过氧化物酶体合成黄酮骨架的可行性，通过靶向乙酰辅酶A羧化酶(Acc1^S569A,S1157A)至过氧化物酶体促进丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)生成；随后重构从柚皮素(naringenin)到紫杉叶素的完整途径，优化细胞色素P450酶系(F3'h/SmCpr^H453V)的电子传递效率；最后通过调控辅因子供应和过氧化物酶体功能容量，显著提升产量。该研究发表于《Microbial Cell Factories》。

关键技术包括：CRISPR-Cas9基因组编辑构建工程菌株；荧光共定位验证ePTS1信号肽的过氧化物酶体靶向功能；HPLC-MS代谢产物定量分析；通过过表达TYR1/ARO8增强α-酮戊二酸(a-ketoglutarate)供应；利用IDP3/ACO2优化过氧化物酶体内NADPH再生系统。

Feasibility validation of compartmentalized flavonoid synthesis in peroxisomes
研究证实细胞质合成的对香豆酸(p-coumaric acid)可被动扩散进入过氧化物酶体，与酶体内部生成的丙二酰辅酶A缩合形成黄酮骨架。表达Ptr4CL5和SjCHS1的菌株WQ7产柚皮素达60.6±1.1 mg/L，较细胞质表达体系提高26%，首次证明过氧化物酶体环境更利于黄酮合成。

Biosynthesis of taxifolin in yeast peroxisomes
筛选获得高效羟化酶组合AtF3H/MsCHI，与突变型细胞色素P450还原酶SmCpr^H453V共表达后，紫杉叶素产量提升至57.6±2.7 mg/L。过氧化物酶体的高氧化还原电位为P450酶系提供了有利微环境。

Impact of peroxisome biogenesis on taxifolin synthesis
调控PEX5/PEX13/PEX14等过氧化物酶体生物发生相关基因未能提高产量，表明当前系统限制因素在于区室代谢容量而非数量，这与Baker等2025年提出的"功能容量"理论相符。

Cofactor engineering improves taxifolin synthesis in peroxisomes
过表达TYR1/ARO8使α-酮戊二酸供应增加，产量提升50.1%至98.5±2.6 mg/L。创新性地将ACO2定位于过氧化物酶体，分流乙醛酸循环代谢流至异柠檬酸/α-酮戊二酸穿梭系统，协同提升NADPH和α-酮戊二酸水平。

Malonyl-CoA supply improves taxifolin synthesis in peroxisomes
通过表达FAT1/FAA2增强脂肪酸活化，最终菌株WQ100产量达120.3±2.4 mg/L，创下最小培养基摇瓶发酵的最高纪录。

该研究首次证明过氧化物酶体区室化策略可拓展至黄酮类化合物合成，突破了传统细胞质合成途径的效率瓶颈。通过重构辅因子再生系统与优化代谢流分配，建立了"乙酰辅酶A-丙二酰辅酶A-黄酮骨架"的过氧化物酶体合成新范式。特别值得注意的是，过氧化物酶体特有的氧化还原环境显著提升了P450酶系的催化效率，这为其他需要复杂氧化还原反应的天然产物合成提供了新思路。研究提出的代谢流分流策略（乙醛酸循环→异柠檬酸穿梭）创新性地解决了区室化合成中的辅因子限制问题，这种"代谢管道"工程方法可推广至其他真核细胞工厂的构建。该成果不仅为紫杉叶素的工业化生产提供了高效菌株，更重要的是建立了真核细胞区室化合成黄酮类化合物的技术体系，为结构更复杂的植物天然产物合成奠定了基础。