利用土壤细菌Acinetobacter baylyi ADP1通过β-酮己二酸途径从木质素相关分子高效生产顺,顺-粘康酸

本研究针对木质素衍生单体（如对香豆酸和芥子酸）无法通过天然代谢途径高效转化为顺,顺-粘康酸（ccMA）的瓶颈问题，开发了基于Acinetobacter baylyi ADP1的生长偶联筛选系统，成功筛选出非依赖辅因子的原儿茶酸脱羧酶（AGDC1），实现83%摩尔产率的ccMA生产，为生物基尼龙前体合成提供了新策略。

　　

在追求可持续发展的时代背景下，生物基化学品的开发成为替代石油基产品的关键。顺,顺-粘康酸（cis,cis-muconic acid, ccMA）作为一种"生物特权分子"，可通过加氢反应转化为尼龙生产的关键前体己二酸，或进一步加工为聚酯原料对苯二甲酸。然而，传统ccMA生产面临两大挑战：一是木质素解聚产生的单体（如对香豆酸和芥子酸）主要通过β-酮己二酸途径（β-ketoadipate pathway）的protocatechuate分支代谢，该分支缺乏ccMA中间体；二是连接两个分支的关键酶——原儿茶酸脱羧酶（protocatechuate decarboxylase, PCADC）存在催化效率低、氧敏感性等问题。

针对这些挑战，芬兰坦佩雷大学的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表创新性研究。他们以天然具备木质素分子代谢能力的土壤细菌Acinetobacter baylyi ADP1（ADP1）为宿主，通过构建生长偶联筛选平台，从五种候选酶中优选出来自酵母Blastobotrys adeninivorans的AGDC1。这种不依赖辅因子的脱羧酶突破了传统AroY型PCADC需要预nylated flavine mononucleotide（prFMN）辅因子的限制。通过系统代谢工程改造，包括删除pcaHG基因阻断protocatechuate分支、过表达catA基因增强catechol转化效率等策略，最终在补料分批培养中实现从木质素水解液主要成分（对香豆酸和芥子酸）到ccMA的83%摩尔产率。

关键技术方法包括：1）建立基于pcaHG基因敲除的生长偶联筛选系统；2）比较五种PCADC（四种AroY型和AGDC1）的催化效率；3）通过组合基因编辑（删除catBC、benR等调控基因）优化代谢流；4）采用HPLC分析代谢产物动态变化；5）在250 mL生物反应器中实施两阶段补料策略（0-28小时添加芳香族底物，28-54小时补充葡萄糖酸）。

研究结果部分：
生长偶联筛选系统
通过删除pcaHG基因阻断protocatechuate分支，构建ASA901底盘菌株。在10 mM 4-羟基苯甲酸筛选条件下，AGDC1表现出与最优AroY型酶相当的生长促进效果（图1B），且无需辅因子补充。

ccMA生产菌株构建
删除catBC基因阻断ccMA降解途径后，菌株ASA916可从苯甲酸100%转化为ccMA（补充图S3）。过表达catA基因的ASA917菌株使对香豆酸的ccMA产率从21.2%提升至40.5%（图2），证实catechol 1,2-双加氧酶（CatA）是限速步骤。

补料分批生产验证
在模拟秸秆木质素水解液（含2.5 mM对香豆酸+2.5 mM芥子酸）的培养中，ASA917表现出83.4%摩尔产率（图3）。值得注意的是，protocatechuate在培养前期积累（0-28小时达0.69 mM），后期被完全转化，显示AGDC1虽高效但仍存在底物转化延迟。

该研究通过创新性的生长偶联筛选策略，首次将酵母来源的AGDC1应用于细菌ccMA生产系统，其不依赖辅因子的特性显著简化了代谢途径设计。相比传统需要prFMN辅因子的AroY型酶，AGDC1在好氧条件下更稳定，为工业化应用奠定基础。研究还揭示通过优化CatA活性和调控蛋白（如BenR）表达可进一步提升产率，这为后续通过蛋白质工程改造提供了明确方向。这项工作不仅推进了木质素高值化利用技术，其建立的筛选平台还可扩展应用于其他芳香族化合物转化酶的定向进化研究。