大花藜芦中维拉嗪生物合成关键基因的鉴定及酵母异源合成体系的构建

本研究针对环杷明(cyclopamine)前体维拉嗪(verazine)生物合成途径不明确的问题，通过甲基茉莉酸(MeJA)诱导结合转录组分析，从大花藜芦(Veratrum grandiflorum)中鉴定出VgCYP90B27、VgCYP94N1、VgCYP90G1和VgGABAT四个关键基因，并在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建高效合成体系，产量达175±1.38μg/L，为抗癌药物前体的可持续生产提供新策略。

　　

在云南高海拔地区的云雾中，生长着一种名为大花藜芦(Veratrum grandiflorum)的珍稀药用植物，其根部富含具有抗癌潜力的环杷明(cyclopamine)。这种甾体生物碱能特异性抑制Hedgehog信号通路，对基底细胞癌等恶性肿瘤显示出治疗前景。然而野生资源的过度采挖和植物体内极低的含量（根中仅0.62 mg/g），严重制约了其临床应用。更关键的是，从胆固醇到环杷明的完整生物合成途径中，关键前体维拉嗪(verazine)的合成机制尚未完全阐明。

云南农业大学的张广辉和何思美团队在《BMC Plant Biology》发表的研究，通过多组学联用技术破解了这一难题。研究人员首先发现甲基茉莉酸(MeJA)处理可使根部环杷明含量提升1.5倍，随即对处理后的根系进行转录组测序，结合表达趋势模块分析锁定4个候选基因。通过酵母异源表达系统验证，首次在大花藜芦中鉴定出VgCYP90B27（催化C-22羟基化）、VgCYP94N1（催化C-26羟基化）、VgCYP90G1（催化C-22酮基化）和VgGABAT（催化C-26氨基化）的功能，构建出产量71.62 μg/L的酵母底盘。创新性地引入茄科植物的GAME4基因后，产量跃升至175 μg/L，创下当前最高记录。

关键技术包括：甲基茉莉酸梯度处理优化、Illumina转录组测序（获得121,370个unigenes）、系统发育树构建（MEGA7.0）、酵母表达载体（Y33质粒）构建及LC-MS代谢产物检测。所有植物材料均采自云南会泽大海草山（东经103°25'4.17"，北纬26°23'58.2"N），经中科院昆明植物所马文张教授鉴定。

外源MeJA处理与环杷明含量变化

通过HPLC分析发现，大花藜芦根部环杷明含量显著高于茎叶（根0.62 vs 叶0.14 mg/g）。100μM MeJA处理48小时后，根部含量提升至1.39 mg/g，为后续转录组分析提供理想样本。

转录组组装与注释

测序获得120.24 GB原始数据，注释到KEGG的55,973个基因中，与萜类代谢相关的CYP450家族基因表达显著上调。差异表达分析显示，4小时处理组即出现苯丙烷代谢、MAPK信号通路等防御反应的激活。

同源基因筛选与生物信息学分析

通过构建系统发育树发现，VgCYP90B27与已知VcCYP90B27同源性达86%，其三级结构预测（SWISS-MODEL）显示典型P450蛋白特征。共筛选出22个CYP450和5个GABAT候选基因，其中4个基因的表达趋势与环杷明积累高度吻合。

酵母异源表达验证

在BY4742酵母菌株中，VgCYP90B27成功将胆固醇转化为22R-羟基胆固醇（m/z 403[M+H]⁺）；VgCYP94N1进一步生成22R,26-二羟基胆固醇（m/z 419[M+H]⁺）；最终VgGABAT与VgCYP90G1协作产生维拉嗪（m/z 398[M+H]⁺）。

酵母底盘优化

引入茄科SlGAME4基因后，维拉嗪产量提升246.48%。该基因通过强化C-26醛基化步骤，突破CYP94N1双功能催化的限速瓶颈。

该研究不仅首次绘制了大花藜芦中维拉嗪的完整合成路线，更通过跨物种基因组合策略显著提升产量。所构建的酵母细胞工厂为环杷明的可持续生产奠定基础，同时为其他甾体生物碱的异源合成提供范本。值得注意的是，不同物种来源的酶组合（如VgCYP94N1与SlGAME4）可产生协同效应，这一发现为天然产物合成生物学研究开辟了新思路。未来通过基因组整合稳定遗传背景，或可进一步突破产量限制。