热耐受酵母K. marxianus着丝粒通过单微管附着机制调控染色体分离的分子机制研究

本研究针对真核生物染色体分离的核心机制，以热耐受酵母Kluyveromyces marxianus为模型，揭示了其点着丝粒（point centromere）通过单一CENP-A核小体介导单微管附着的独特结构特征。通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）和单分子染色质纤维测序（Fiber-seq）技术，研究人员发现尽管K. marxianus着丝粒CDEII区域长度是酿酒酵母的2倍，但仍保持单核小体架构，且电镜重建显示每个着丝粒仅结合一根微管。该研究为理解着丝粒进化与微管附着多样性提供了新视角，成果发表于《Chromosome Research》。

　　

在真核生物的细胞分裂过程中，着丝粒（centromere）作为染色体分离的"指挥中心"，通过组装动粒（kinetochore）复合体与纺锤体微管（microtubule）结合，确保遗传物质精确分配。尽管这一机制在模式生物酿酒酵母（S. cerevisiae）中已被阐明——其125 bp的点着丝粒通过单个CENP-A核小体介导单微管附着，但其他酵母物种的着丝粒架构仍存在诸多谜团。尤其引人注目的是耐热酵母Kluyveromyces marxianus，其着丝粒CDEII区域长达165 bp（是S. cerevisiae的2倍），暗示可能存在更复杂的核小体组织方式。更奇特的是，此前纯化的K. marxianus动粒颗粒中约40%呈现"双联体"（doublet）形态，这究竟是反映了双微管附着特性，还是实验假象？这一科学问题直接关系到对真核生物着丝粒进化与功能多样性的理解。

为破解这一谜题，美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Center）的Daniel J. Barrero、Sue Biggins团队联合华盛顿大学等多个机构，在《Chromosome Research》发表了突破性研究成果。通过整合前沿的生物物理学、结构生物学和基因组学技术，他们首次揭示了K. marxianus着丝粒-动粒-微管三元复合体的精确组装机制。

研究团队运用三大关键技术：1）光学捕获（optical trapping）技术定量分析核酸酶处理前后动粒-微管结合强度差异；2）高压冷冻-冷冻替代（HPF/FS）结合电子断层扫描重建完整纺锤体三维结构；3）单分子染色质纤维测序（Fiber-seq）解析着丝粒核小体空间占据情况。实验样本采用内源性标记的K. marxianus NRRL Y-8281菌株。

双联动粒的功能影响
通过比较核酸酶（benzoase）处理前后的动粒颗粒，研究发现双联体结构能显著增强微管结合强度（中位破裂力7.5 pN vs 6.4 pN），但蛋白组成分析（质谱检测）显示处理前后所有动粒亚复合体均保留完整。这提示双联体可能代表功能性单元而非纯化假象。

细胞周期动态保守性
活细胞成像显示Dad1-mKate2标记的动粒在细胞周期中呈现与S. cerevisiae相似的定位模式：未出芽细胞中单焦点聚集，出芽后期形成双焦点（中位间距0.42 μm）。冷冻电镜测量的双联体长度（375 nm）与活细胞观测值高度吻合，排除了技术假象可能。

纺锤体微管定量重建
对6个有丝分裂纺锤体的三维重建显示，每个纺锤体极体（SPB）仅发出10-15根微管，远少于S. cerevisiae的38-43根。考虑到K. marxianus具有8条染色体，该数据强烈支持"单染色体-单微管"模型。

单核小体表观证据
Fiber-seq数据显示所有8个着丝粒均呈现连续227 bp的未甲基化保护区域（S. cerevisiae为165 bp），且核小体占据密度在着丝粒中心达到峰值。这种单一保护模式排除了双核小体存在的可能。

这项研究最终证实：尽管K. marxianus着丝粒CDEII区域扩展，但仍维持单CENP-A核小体架构，并通过单一微管完成染色体分离。该发现打破了"序列长度决定核小体数量"的传统认知，揭示着丝粒功能模块在进化过程中的惊人保守性。特别值得注意的是，双联动粒的力学特性暗示其可能代表一种新型调控状态，为理解动粒可塑性提供了新线索。从技术层面看，研究建立的耐热酵母动粒纯化体系（Barrero et al., 2024）为后续结构解析开辟了新途径。这些发现不仅深化了对染色体分离分子机器的认识，也为癌症等染色体不稳定疾病的机制研究提供了新视角。