棉铃虫共生芽孢杆菌通过分泌核酸酶降解dsRNA降低宿主RNAi敏感性的机制研究

本研究揭示了棉铃虫(Helicoverpa armigera)肠道共生芽孢杆菌通过分泌核糖核酸酶(Ribonuclease)降解双链RNA(dsRNA)，从而降低宿主RNA干扰(RNAi)效率的分子机制。研究人员筛选出6株具有dsRNA降解活性的芽孢杆菌菌株，通过基因组分析和功能实验证实其分泌的核酸酶能直接破坏RNAi核心元件，为RNA生物农药在鳞翅目害虫防治中的应用瓶颈提供了新的解决思路。

　　

在农业害虫防治领域，RNA干扰(RNAi)技术被誉为革命性的新一代防控手段，通过特异性沉默害虫生长发育关键基因实现精准杀灭。然而这一技术在鳞翅目害虫（如棉铃虫）中始终面临效率低下的困境，严重制约其实际应用。以往研究多聚焦于昆虫自身生理屏障，而上海某研究机构团队独辟蹊径，将目光投向了一个长期被忽视的关键因素——肠道共生微生物与RNAi通路的互作关系。

研究团队发现棉铃虫中肠液和血淋巴对dsRNA表现出异常强烈的降解活性，通过宏基因组测序锁定芽孢杆菌(Bacillus)为优势菌属。从幼虫肠道分离的6株芽孢杆菌（Ba 1-Ba 6）在体外均能高效降解dsRNA，其中Ba 6（经鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus）的降解活性最为显著。通过全基因组测序和分泌蛋白分析，研究者发现这些菌株携带多种细胞外核酸酶基因，而Ba 6仅分泌单一核糖核酸酶(Ribonuclease)，该酶在体外和体内实验中均被证实可直接切割dsRNA分子。

关键技术方法包括：棉铃虫肠道菌群宏基因组测序（样本为4-5龄幼虫中肠内容物）、细菌全基因组测序（Illumina HiSeq平台）、RNase活性检测平板实验、Western blot验证核糖核酸酶表达、荧光标记dsRNA体内追踪技术，以及通过喂食/注射两种方式评估RNAi效率（靶基因为羧酸酯酶CarE和钙粘蛋白BtR）。

主要研究结果

dsRNA在棉铃虫体液中极不稳定
宏基因组分析显示棉铃虫中肠优势菌群为肠球菌属(Enterococcus)和芽孢杆菌属，KEGG通路富集于核苷酸代谢等途径。未稀释的中肠液和血淋巴可在短时间内完全降解dsRNA，提示昆虫内环境是影响RNAi效率的关键因素。

具有dsRNA降解活性的肠道共生菌筛选
通过琼脂糖凝胶电泳从32株分离菌中鉴定出6株具有dsRNA降解能力的芽孢杆菌。RNase活性检测显示Ba 3和Ba 6活性最强，其培养上清同样具有降解活性，证实这些菌株通过分泌胞外核酸酶发挥作用。

共生菌特征解析
全基因组测序显示Ba 1/Ba 5为高原芽孢杆菌(B. altitudinis)，其余为蜡样芽孢杆菌。系统发育分析发现这些菌株的核酸酶属于DNase_NucA_NucB、EndA等超家族，其中Ba 6仅分泌一种含EndA结构域的核糖核酸酶。

Ba 6对棉铃虫生长发育无显著影响
喂食实验表明Ba 6可成功定植肠道并改变菌群结构（变形菌门→厚壁菌门），但幼虫体长、体重等生理指标无显著变化。这提示其RNAi抑制功能独立于传统致病机制。

Ba 6降低宿主RNAi效率
荧光标记dsRNA在Ba 6定植幼虫体内降解加速；注射dsCarE/dsBtR后靶基因沉默效率下降40-60%。关键RNAi通路基因Ago-2(Argonaute-2)和Dicer表达受抑制。喂食实验进一步证实Ba 6上清和纯化核糖核酸酶均可显著降低害虫死亡率（从70%降至30%）。

Ba 6效应因子鉴定
热灭活实验证实降解活性来自蛋白质组分。Western blot检测到Ba 6上清中存在预测的核糖核酸酶，重组表达该酶在体外展示出与菌株上清相当的dsRNA降解能力。

研究揭示鳞翅目昆虫肠道高pH环境（pH 11-12）特别适合芽孢杆菌增殖，其分泌的核酸酶与昆虫内源性核酸酶协同作用，形成双重屏障阻碍外源dsRNA吸收。该发现不仅解释了RNAi在鳞翅目害虫中效率低下的核心原因，更提出了"微生物群落调控"的新型增效策略——通过靶向清除特定共生菌或改造其代谢特性，有望突破当前RNA生物农药的应用瓶颈。

这项发表于《npj Biofilms and Microbiomes》的研究首次建立了"昆虫-共生菌-RNAi效率"三者的分子互作网络，为发展下一代环境友好型害虫防控技术提供了理论基石。鉴于芽孢杆菌在农业领域的广泛应用，该发现对RNAi制剂的大田应用具有重要指导价值，提示未来需综合考虑环境微生物群落对RNAi效果的潜在影响。