黑核桃壳发育过程中木质素生物合成关键基因家族PAL和CAD的全基因组鉴定与表达调控研究

本研究针对黑核桃(Juglans nigra)壳发育过程中木质素合成的分子机制不明问题，通过全基因组鉴定和转录组分析，系统研究了苯丙氨酸解氨酶(PAL)和肉桂醇脱氢酶(CAD)基因家族的动态表达模式。研究发现JnPAL1/2/6和JnCAD2/3在壳发育过程中显著上调，揭示了这些基因在调控核桃壳木质化中的关键作用，为核桃品质改良提供了重要分子靶点。

　　

核桃作为重要的经济林木，其坚果和木材都具有极高的商业价值。然而，核桃壳的厚度直接影响坚果的加工品质，而木质素作为决定壳硬度的关键成分，其合成机制在核桃中仍不清楚。特别是在黑核桃(Juglans nigra)这一重要树种中，虽然已知苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)和肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)是木质素生物合成途径中的关键酶，但这些基因家族的系统鉴定及其在核桃壳发育过程中的表达调控模式仍缺乏深入研究。

西北农林科技大学等单位的研究人员针对这一科学问题，在《BMC Plant Biology》发表了最新研究成果。研究团队通过对黑核桃三个发育阶段(开花后80天、111天和140天)的壳和仁进行转录组测序，结合全基因组分析，系统鉴定了PAL和CAD基因家族，揭示了这些基因在核桃壳木质化过程中的动态表达模式。研究发现JnPAL1/2/6和JnCAD2/3在壳发育过程中显著上调，为理解核桃壳形成的分子机制提供了重要线索，对核桃品质改良育种具有重要指导意义。

研究采用了多项关键技术方法：通过Illumina平台对三个发育阶段的核桃壳和仁进行转录组测序；使用HISAT2将reads比对到参考基因组；采用DESeq2进行差异表达基因分析；利用TBtools进行基因结构和motif分析；通过PlantCARE数据库预测顺式作用元件；运用qRT-PCR验证候选基因表达模式。样本来自西北农林科技大学果园种植的成年树，每个发育阶段设置三个生物学重复。

研究结果部分主要包括以下发现：

1. Transcriptome analysis of three development stages of black walnut shells
   转录组分析发现黑核桃壳三个发育阶段存在7597个差异表达基因，其中4446个上调，3151个下调。KEGG富集分析显示这些基因显著富集于MAPK信号通路、代谢通路和苯丙烷生物合成通路。特别值得注意的是，与木质素合成相关的基因如JnPAL、Jn4CL、JnC3'H等在壳发育早期(80 DAF)显著上调。

1. Transcriptomics profiling of Juglans nigra shells and kernels in lignin biosynthesis
   通过维恩图分析发现52个在S1 vs S2和S2 vs S3阶段共有的差异表达基因，这些基因显著富集于苯丙烷生物合成通路。研究人员鉴定出多个木质素合成相关基因，包括JnPAL、JnCOMT、JnCCR、Jn4CL和JnCAD，其中JnCAD2和JnCAD-like在所有三个阶段都表现出差异表达。

1. The phylogenetic tree, chromosomal locations and duplication patterns of the PAL and CAD gene family
   全基因组鉴定发现黑核桃(J. nigra)和小核桃(J. microcarpa)分别含有7个和5个PAL基因，以及各3个CAD基因。系统发育分析将PAL分为4个组，CAD分为4个组。染色体定位显示JnPAL基因分布在5条不同染色体上，而CAD基因分散在不同染色体。复制模式分析表明50%的PAL和全部CAD基因经历了全基因组复制事件。

1. Protein domain and gene structure analysis
   蛋白结构域分析显示所有PAL蛋白都含有PLN02457保守结构域，CAD蛋白含有PLN02514结构域。基因结构分析发现PAL基因可分为两组：一组含有两个CDS和长内含子，另一组只有一个长CDS。CAD基因也呈现明显的结构分化，部分成员缺少UTR区域。

1. Protein-protein interactions and MicroRNA targeting analysis
   蛋白互作预测显示PAL和CAD与多种蛋白存在相互作用，包括MYB转录因子、过氧化物酶和UGT72等。miRNA靶向分析发现JnPAL6与33个miRNA存在潜在互作，JnCAD2与25个miRNA互作。这些互作网络暗示PAL和CAD可能受到复杂的转录后调控。

1. Evolution of PAL and CAD
   表达模式分析显示JnPAL6、JnPAL2、JnPAL1和JnCAD3、JnCAD2在核桃壳中的表达量显著高于核仁。qRT-PCR验证证实这些基因在壳发育后期(60-92 DAF)表达量持续增加，与转录组数据一致。进化分析表明PAL和CAD在被子植物中高度保守，但核桃PAL基因含有更长的内含子。

研究结论部分指出，该研究首次在黑核桃中系统鉴定了PAL和CAD基因家族，发现JnPAL1/2/6和JnCAD2/3在壳发育过程中特异性高表达，这些基因可能通过调控木质素合成决定核桃壳的硬度。蛋白互作和miRNA调控网络分析揭示了这些基因可能参与的复杂调控机制。研究不仅为理解核桃壳发育的分子基础提供了新见解，也为通过基因辅助育种改良核桃品质提供了重要靶点。特别值得注意的是，研究发现CAD基因在核桃中高度保守，而PAL基因则表现出更大的变异性和物种特异性，这一发现对理解木质素合成途径的进化具有重要意义。