氨基酸激活核酶KK13的结构精简及其在原始地球环境中的功能演化

为解决原始地球环境中短链RNA催化氨基酸激活的难题，研究人员针对114 nt的KK13核酶开展结构精简研究。通过mfold和AlphaFold3预测二级/三级结构，构建Δstem2(87 nt)、Δstem23(58 nt)等系列突变体。实验证实Δstem234(49 nt)保留70%活性，突破原始RNA长度限制(约50 nt)，为RNA世界假说中氨基酸激活机制的演化提供关键证据。

　　

生命起源的核心谜题之一在于遗传信息与催化功能的"先有鸡还是先有蛋"困境。随着核酶（具有催化功能的RNA）的发现，科学家提出"RNA世界"假说——在蛋白质出现前，RNA可能同时承担遗传信息存储和生物催化双重功能。这一假说面临的关键挑战是：现代生物体内氨基酸激活需要复杂的氨基酰-tRNA合成酶(aaRS)，而原始地球环境仅能支持短链RNA（约50 nt）的存在。如何用短链RNA实现氨基酸激活成为验证假说的关键环节。

日本某研究机构团队在《BioSystems》发表的研究聚焦KK13核酶，这种114 nt的RNA能催化氨基酸与5′-三磷酸末端形成酰基磷酸酐键（类似aaRS催化的氨基酰-AMP）。研究通过mfold预测二级结构、AlphaFold3模拟三级结构，系统构建Δstem2(87 nt)、Δstem23(58 nt)、Δstem234(49 nt)等缺失突变体，采用孔雀石绿(MG)法检测吡啶酸释放量评估活性。

【材料与方法】
研究采用T7 RNA聚合酶体外转录制备RNA，通过12%变性PAGE胶纯化。氨基酸激活反应在pH 4.0缓冲体系中进行，利用无机焦磷酸酶(PPiase)将释放的PPi转化为磷酸，通过MG溶液显色定量（620 nm检测）。结构预测采用mfold服务器和AlphaFold3网络平台。

【结果】

1. 活性验证：KK13对苯丙氨酸(Phe)的激活活性高于丙氨酸(Ala)，阴性对照minihelix^Ala(MH^Ala)活性仅为KK13的20-25%（图2）。
2. 结构精简：Δstem2(87 nt)保留80%活性，Δstem23(58 nt)和Δstem234(49 nt)分别保持70%活性（图5）。25 nt的stem1Δs活性骤降至40%，提示stem1对结构稳定至关重要。
3. 关键区域：删除3′端9 nt单链区(tip3′)使活性降低70%，表明该区域可能参与活性中心构象维持（图5）。
4. 结构预测：AlphaFold3显示KK13呈三向连接结构，stem1与stem2共轴堆叠，而Δstem2中stem3翻转与stem1堆叠（图4）。

【讨论与意义】
该研究首次将氨基酸激活核酶精简至接近原始地球RNA长度极限的49 nt（Δstem234），突破性地证明短链RNA可实现氨基酸激活。三个重要发现支撑了RNA世界假说：

1. 结构精简性：仅保留stem1和部分连接区的Δstem234仍保持高效活性，暗示原始核酶可能通过模块化结构演化。
2. 功能保守性：3′端tip3′区域的关键作用反映现代aaRS的保守域功能可能源于原始RNA的结构特征。
3. 进化启示：Δstem23与Δstem234的活性差异（70% vs 30%）说明RNA需要适度结构稳定性（反映在mfold自由能值），为理解前生命分子选择压力提供线索。

研究遗留的关键问题是KK13仅完成氨基酸激活（类似aaRS第一步），而现代aaRS能连续完成激活和转移两步反应。未来需探索如何将KK13与flexizyme类转移核酶功能整合，这将为揭示完整翻译系统的起源提供更直接证据。论文通过结构生物学与进化生物学的交叉研究，为生命起源化学演化路径补上了重要一环。