DON和PRRSV共暴露通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响PAM-KNU细胞自噬

　　

摘要：

【目的】 环境因素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和传染性病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）作为对我国养猪业造成严重危害的两种因素，两者在临床中常同时发生，但鲜有两者共暴露的研究，其具体机制也尚不清楚。通过探究DON和PRRSV双重暴露下对宿主细胞猪肺泡巨噬细胞（PAM-KNU）的影响，为养猪业的环境要求提供理论参考。【方法】 将扩增收集后的PRRSV进行梯度稀释，通过显微镜观察PRRSV感染后的Marc-145细胞的病变现象（CPE），计算出病毒的滴度。用MOI=1的PRRSV感染PAM-KNU细胞，通过蛋白免疫印迹分别在0、12、24、36、48、60和72 h检测细胞中PRRSV-N的表达量及上清液病毒滴度，筛选出合适的时间。在选定时间下，通过CCK-8法分别检测0、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048 nmol·L^-1浓度的DON对PAM-KNU细胞活力的影响，以此选出合适的4个DON浓度进行后续试验。将4个不同浓度DON与PRRSV共暴露于PAM-KNU细胞中，通过蛋白免疫印迹检测PRRSV-N蛋白表达量，选定最终DON浓度。在此基础上建立DON和PRRSV共暴露细胞模型，具体分组为对照组（C组）、DON组（D组）、PRRSV组（V组）和DON+PRRSV组（VD组）。通过电镜观察PAM-KNU细胞内自噬情况，Western Blot和间接免疫荧光对LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、ULK 1蛋白进行自噬水平检测，应用Astral DIA技术进行蛋白质组测序，对差异蛋白进行KEGG通路富集分析，并对富集到的PI3K/AKT/mTOR通路进行蛋白表达验证。【结果】 通过观察CPE现象，计算出PRRSV的滴度为10^7.3 TCID₅₀/mL。PRRSV在PAM-KNU细胞的生长动力曲线显示，细胞中PRRSV-N蛋白的表达量在24 h时达到指数增长期。CCK-8结果显示，DON浓度为8、16、32、64 nmol·L^-1时，对PAM-KNU细胞活力无显著影响，当DON浓度大于等于128 nmol·L^-1时，对细胞活力有显著影响，且细胞活力逐渐下降。将其中的4个DON浓度（32、128、256、512 nmol·L^-1）与PRRSV共暴露于PAM-KNU细胞中，Western Blot结果显示DON浓度为128 nmol·L^-1时，PRRSV-N蛋白表达量开始显著下降。在此基础上建立PAM-KNU细胞模型。透射电镜结果显示，与D组和V组相比，VD组自噬小体减少，同时LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、ULK 1蛋白表达量显著降低，表明自噬水平被抑制。通过蛋白质组学测序筛选差异蛋白，并进行KEGG分析，富集到多条通路，本实验对PI3K/AKT/mTOR通路进行验证，Western Blot结果显示，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表达量上升，与间接免疫荧光结果一致。【结论】 DON与PRRSV共暴露通过上调PI3K/AKT/mTOR通路显著抑制PAM-KNU细胞的自噬水平。这种抑制可能导致宿主细胞免疫反应失调，从而影响宿主细胞对病原体的反应能力。