芽孢杆菌脂蛋白N端乙酰化修饰：细胞外乙酰化新范式与物种依赖性Toll样受体2免疫调节

本研究揭示了芽孢杆菌脂蛋白N端乙酰化（Ac-LP）的全新通路，发现七异戊二烯基甘油（Ac-HepG）作为高能乙酰载体，由LhaT（原YpjA）介导细胞外乙酰转移。该机制不仅阐明了病原体（如炭疽芽孢杆菌）通过聚酪氨酸插入使LhaT失活以逃逸TLR2免疫监视的进化策略，更为跨膜乙酰化供体运输提供了范式突破。

　　

ABSTRACT
脂蛋白作为细菌膜表面的标志性成分，其N端半胱氨酸残基的酰化修饰不仅锚定蛋白质于细胞表面，更成为哺乳动物先天免疫系统通过Toll样受体2（TLR2）识别病原体的关键配体。研究以模式菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为对象，发现其脂蛋白经Lsp蛋白酶切割后形成的二酰基脂蛋白（DA-LP）会进一步被N-乙酰化（Ac-LP），而这一过程需要三个关键元件：胞质中的PcrB/YvoF合成乙酰化七异戊二烯基甘油（Ac-HepG）载体，以及膜整合蛋白LhaT（原YpjA）介导的乙酰基转移。

RESULTS
Co-expression of lyso- and Ac-LP suppresses TLR2 signaling
通过构建异源表达肠球菌lit基因（编码脂蛋白分子内酰基转移酶）的工程菌株，证实lyso-LP与Ac-LP的竞争性生成可显著抑制TLR2/6信号通路。当使用强启动子驱动lit表达时，TLR2激活水平降低10倍，质谱分析显示代表性脂蛋白Frxb存在Ac-LP与lyso-LP混合群体。

Deletion of PcrB, YvoF, or YpjA prevents lipoprotein N-acetylation
转座子突变筛选锁定四个关键基因簇：lgt/lsp（脂蛋白生物合成早期酶）、pcrB（单顺反子）、ypjA以及多顺反子hprK-lgt-yvoD-yvoF。非极性敲除实验证实仅pcrB、yvoF和ypjA的缺失会完全阻断Ac-LP生成，质谱检测显示Frxb脂肽质量减少42 Da（对应乙酰基丢失）。

Reconstitution of the lipoprotein N-acetylation pathway
体外重构实验揭示：PcrB催化sn-甘油-1-磷酸（G1P）与七异戊二烯焦磷酸（HepPP）缩合生成HepG，经碱性磷酸酶去磷酸化后，YvoF以乙酰辅酶A（Ac-CoA）为供体合成Ac-HepG。加入LhaT与荧光标记DA-LP底物后，薄层色谱（TLC）出现迁移率更高的斑点，质谱证实为Ac-LP（+42 Da）。

The lipoprotein N-acetylation pathway has decayed in certain pathogenic Bacillus spp.
炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）虽保留lhaT基因，但其C端存在4-18个酪氨酸残基（poly-Tyr）插入。AlphaFold预测该插入破坏第六跨膜α螺旋结构，实验显示野生型LhaT^Ba无活性，而替换为枯草芽孢杆菌YFL模体后可恢复乙酰转移功能。

DISCUSSION
该研究提出Ac-HepG作为新型高能乙酰载体，突破性地解决了细胞外乙酰化供体运输的难题。在进化层面，致病性芽孢杆菌（如炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌）通过lit基因获得和lhaT′假基因化实现TLR2免疫逃逸，而环境菌株则维持Ac-LP通路完整。这种乙酰化修饰的物种依赖性差异，为理解病原体与宿主的免疫博弈提供了新视角。

MATERIALS AND METHODS
采用HEK-Blue hTLR2报告细胞系定量NF-κB信号，通过MALDI-TOF质谱解析脂肽结构。重组蛋白表达使用E. coli BL21(DE3)系统，膜蛋白LhaT在去脂化工程菌TXM2540中制备。体外重构实验采用Bligh-Dyer法提取脂质，TLC与免疫印迹验证活性。