脂质环境中α-溶血素预孔中间体的结构解析揭示金黄色葡萄球菌膜穿孔机制

本研究针对金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素（α-HL/Hla）在宿主细胞膜上形成跨膜孔的分子机制这一未解难题，通过单颗粒冷冻电镜技术首次解析了野生型α-溶血素在10:0 PC、Egg-PC/胆固醇等不同脂质环境中形成的预孔中间体（pre-pore）及成熟孔（pore）的高分辨率结构（2.6-3.07 ?），发现鞘磷脂（sphingomyelin）诱导的膜刚性可显著增加预孔构象比例，揭示了β-桶状孔道（β-barrel）形成过程中脂质-蛋白互作的关键界面，为理解小分子β-孔形成毒素（β-PFTs）的致病机制提供了结构基础。

　　

金黄色葡萄球菌作为常见致病菌，其分泌的α-溶血素（α-HL/Hla）能通过穿孔宿主细胞膜导致严重感染。尽管过去研究发现这类β-孔形成毒素（β-PFTs）通过寡聚化形成跨膜孔道，但预孔中间体的结构特征及其与脂质膜的动态互作机制始终是未解之谜。尤其令人困惑的是：野生型毒素如何在天然脂质环境中完成从可溶性单体到跨膜孔道的转变？不同膜组分如何调控这一过程？

针对这些问题，印度科学研究所（Indian Institute of Science）的研究团队在《Nature Communications》发表了突破性成果。研究人员创新性地将冷冻电镜技术与单分子成像相结合，首次捕获了α-溶血素在脂质双层中形成的三种高分辨率构象：无跨膜段的预孔（pre-pore）、半β-桶状的晚期预孔（late pre-pore）以及成熟孔（pore）。研究发现鞘磷脂通过增加膜刚性使预孔构象比例提升至60%，而短链脂质（10:0 PC）更易诱导膜破裂并稳定36 ?长的跨膜域。通过突变验证，首次明确W179、Y191等残基构成的"边缘域（rim domain）"是脂质结合的关键位点，为开发新型抗毒素药物提供了精准靶点。

关键技术方法
研究采用Ni-NTA亲和层析和分子排阻色谱纯化重组α-溶血素，通过溶血实验验证活性；构建10:0 PC、Egg-PC/胆固醇等不同组成的脂质体模拟生物膜；结合负染电镜（NS-TEM）、全内反射荧光显微镜（TIRFM）和共聚焦成像动态观察膜穿孔过程；采用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析2.6-3.07 ?分辨率结构；通过位点定向突变（SDM）验证关键脂质结合残基。

主要研究结果

脂质组成决定孔道构象
在10:0 PC脂质体中捕获到2.9 ?分辨率的预孔结构（图1d），其边缘域锚定在脂质头基但缺乏跨膜β-桶状结构。相比之下，Egg-PC/胆固醇环境更易形成成熟孔（3.07 ?），其36 ?长的β-桶状域完全插入双层膜（图2f）。冷冻电镜密度图首次显示16:0-18:1 PC链与W179、Y191等残基的相互作用（图2g）。

鞘磷脂稳定中间态
鞘磷脂（SM）使膜刚性增加，导致10:0 PC/SM脂质体中晚期预孔构象占比达60%（图4j）。该结构显示半β-桶状域被厚脂质层包裹（图4d），而N188、W179等残基在底部边缘域形成新的脂质结合位点（图4h）。

N端调控孔道成熟
结构比对发现N端片段（A1-T9）通过相邻原体的帽结构域（cap domain）稳定寡聚体（图6a）。截断实验证实该片段缺失会完全消除溶血活性（图6d），表明其通过空间位阻促进预茎环（pre-stem）解离。

讨论与意义
该研究突破了传统 detergent 溶解条件下仅能获得孔结构的局限，首次在近生理环境中揭示α-溶血素的动态穿孔路径：边缘域先锚定膜表面→N端介导寡聚化→预茎环重构形成半β-桶→最终插入脂质双层。发现鞘磷脂通过增加膜刚性"冻结"中间态，解释了病原体在富含SM的红细胞膜上的作用特征。

这一成果为理解β-PFTs家族（如气单胞菌溶素、炭疽毒素）的进化保守机制提供了范式，其揭示的脂质-蛋白互作界面为设计针对膜穿孔毒素的抑制剂开辟了新途径。特别值得注意的是，研究中建立的"脂质环境调控冷冻电镜"策略，为其他膜蛋白动态组装过程的研究提供了方法论参考。