溴代炔酮试剂实现硫醇-硫醇仿生点击交联：一种高效稳定的生物共价连接新策略

本研究针对传统硫醇-硫醇点击反应存在产物稳定性差和异源二聚体选择性低的难题，开发了新型溴代炔酮(BYO)试剂。通过动力学分步控制策略，研究人员在温和水相条件下实现了两种不同硫醇分子的单碳桥联交联，成功构建了包括蛋白质-蛋白质异源二聚体在内的多种稳定生物偶联物。该工作为精准生物偶联提供了新工具，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

在生物医学研究和治疗开发领域，精准控制分子间的共价连接犹如搭建微观世界的"乐高积木"。其中，硫醇(-SH)因其广泛存在于生物分子中且反应活性可控，成为点击化学(click chemistry)的明星基团。然而科学家们长期面临一个棘手难题：如何像自然界形成二硫键那样，选择性地将两个不同硫醇分子通过单碳原子连接起来？传统氧化偶联法不仅产物稳定性差，更会生成难以分离的均聚物和杂聚物混合物。

比利时根特大学(Universiteit Gent)的Johan M. Winne团队在《Nature Communications》发表突破性研究，开发出基于溴代炔酮(bromo-ynones, BYO)的"硫醇-硫醇交叉点击"新策略。这种试剂通过巧妙的动力学控制，先以闪电般的速度(1780 M^-1s^-1)完成第一个硫醇的炔基取代，再以适中速度(135 M^-1s^-1)实现第二个硫醇的迈克尔加成，最终形成稳定的酮烯二硫缩醛(ketene dithioacetal, KDTA)结构。整个过程无需中间体纯化，在水相缓冲液中即可一步完成，甚至能实现蛋白质-蛋白质的精准偶联。

关键技术包括：1）建立pH控制的硫醇分步偶联反应体系；2）开发溴代炔酮和溴代炔酰胺两类试剂的稳定性调控策略；3）采用竞争动力学实验定量测定反应速率；4）应用LC-MS和SDS-PAGE分析蛋白质偶联产物；5）通过谷胱甘肽挑战实验评估产物稳定性。

【研究结果】
【Study of homodimer synthesis】
研究发现BYO试剂1在pH 8缓冲液中与硫醇反应呈现显著动力学差异：首步溴代炔基取代在数秒内完成，而第二步硫醇-迈克尔加成需数分钟。这种特性使得N-乙酰基-O-甲基半胱氨酸等硫醇能高效形成对称二聚体（产率>95%），并成功用于环状二硫肽链的重桥接。

【Stability studies and stability improvement】
稳定性测试显示，BYO衍生的KDTA在生理条件下可稳定存在数天，对三(2-羧乙基)膦(TCEP)耐受性良好。与经典二溴马来酰亚胺产物相比，BYO产物的硫醇交换速率降低10倍以上。引人注目的是，将溴代炔酮替换为溴代炔酰胺(BYA)14后，所得KDTA 15在100倍谷胱甘肽存在下三天仍保持90%完整性。

【Thiol-thiol cross-clicking】
通过分步策略，研究人员成功构建了硫辛酸-荧光素（21）、谷胱甘肽-生物素（23）等多种异源二聚体。特别是一锅法实验中，仅需控制pH即可实现两种硫醇（如肽段与生物素）的精准交叉连接，产物36-37的分离产率达85-92%。

【Thiol-functional protein conjugation study】
将抗EGFR纳米抗体EgA1-nb-Cys与含单半胱氨酸的Alphabody MB23通过BYO 1直接偶联，成功获得位点专一的蛋白质异源二聚体。SDS-PAGE和LC-MS分析证实产物纯度高，且BYA 14构建的偶联物在生理条件下稳定性显著提升。

【Methodological benchmarking and diversification】
动力学研究表明，BYO的首步点击速率比马来酰亚胺快1.4倍，且专一性更优。该方法对赖氨酸等亲核基团表现出完美选择性，但半胱氨酸等双亲核试剂会导致杂环副产物（如噻唑啉46）。

这项研究建立了硫醇-硫醇点击化学的新范式。BYO试剂通过独特的动力学分级控制，实现了生物分子间单碳桥联的精准构建，其反应速率差异达13倍之多。与现有技术相比，该方法具有三大优势：1）完全化学计量反应避免过量试剂使用；2）水相条件兼容生物分子；3）产物稳定性可经试剂结构理性调控。特别是蛋白质-蛋白质异源二聚体的成功构建，为抗体-药物偶联物(ADC)和双特异性抗体开发提供了新思路。研究者还开创性地通过三唑二酮(PTAD)后修饰进一步稳定KDTA结构，为可调控的生物偶联系统设计开辟了新途径。这些发现将推动化学生物学和生物医药领域精准偶联策略的发展。