GoSPGF-GoPGF-GhWRKYs转录级联调控陆地棉茎部色素腺体形成的分子机制解析

这篇研究揭示了陆地棉茎部色素腺体形成的核心调控通路——GoSPGF-GoPGF-GhWRKYs转录级联。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组整合分析，首次描绘了腺体细胞的发育轨迹，证实GRAS家族转录因子GoSPGF通过结合GoPGF启动子的"AGAC"基序激活其表达，进而调控下游含G-box/MYC元件的GhWRKYs基因。病毒诱导基因沉默（VIGS）实验显示WRKYs特异性调控茎和叶柄腺体形成，为培育低棉酚（glandless）棉花提供了新靶点。

　　

单细胞测序揭示腺体细胞发育轨迹
通过分析27,212个陆地棉茎尖细胞的单细胞转录组数据，研究团队成功分离出占比2.8%的色素腺体细胞群（cluster 16），该群体高表达腺体形成关键因子GoPGF及棉酚合成相关基因CYP82D113、2-ODD等。进一步亚群分析将腺体发育分为四个阶段：薄壁细胞（subcluster 0）→分泌薄壁细胞（subcluster 2）→凋亡前细胞（subcluster 1）→晚期凋亡细胞（subcluster 3）。伪时序分析显示，棉酚合成基因如HMGR、CYP706B1的表达量沿发育轨迹持续升高，在凋亡阶段达到峰值。

空间转录组锁定茎部特异性调控网络
结合10x Visium空间转录组技术，研究发现腺体缺失材料T582的茎部区域显著缺乏WRKY70、WRKY46等基因表达。差异表达基因（DEGs）富集分析显示，茎部腺体形成与"膜结构"（凋亡特征）和"苯丙烷类化合物合成"通路密切相关。值得注意的是，19个WRKY家族转录因子在GoPGF的CUT&Tag分析中被鉴定为潜在靶标，其中5个基因（WRKY6、WRKY40等）在腺体棉中的表达量显著高于腺体缺失品种Hai#1。

GoSPGF-GoPGF层级调控机制解析
实验证实GRAS蛋白GoSPGF通过直接结合GoPGF启动子-515至-464 bp区域的"AGAC"核心序列激活其转录。酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）显示，正常GoSPGF蛋白能特异性识别该位点，而缺失GRAS结构域的突变体（T582材料来源）则丧失结合能力。双荧光素酶报告系统（DLA）进一步验证，GoSPGF可使GoPGF启动子活性提升3.2倍。

下游WRKYs的茎部特异性调控
CUT&Tag测序在6667个基因启动子区鉴定出GoPGF结合位点，其中202个为转录因子。关键发现是GoPGF通过结合G-box（5'-CA(C/T)GTG-3'）和MYC（5'-CA(A/T)TTG-3'）元件调控GhWRKYs表达。病毒诱导基因沉默（VIGS）实验显示，同时沉默5个WRKY基因可使茎部腺体数量减少76%，而叶片腺体不受影响。竞争性EMSA实验揭示，显性突变体mGoPGF（Gl₂^e等位基因）虽能更强结合MYC元件，但丧失转录激活功能，形成对正常GoPGF的竞争性抑制。

多组织调控通路的进化意义
该研究首次阐明茎部特异性腺体形成的"GoSPGF→GoPGF→GhWRKYs"三级调控模块，与已报道的叶片调控因子GhERF105、全株调控因子GhJUB1形成空间互补网络。这种组织特异性调控机制为创制"茎腺体缺失而种子腺体保留"的棉花新种质提供了理论依据，同时为植物特化腺体（如薰衣草腺毛、番茄腺鳞）的进化研究提供了重要参考。