三氯乙烯代谢物DCVC诱导巨噬细胞免疫抑制的分子机制及其对妊娠期感染易感性的影响

本文揭示了环境污染物三氯乙烯（TCE）的关键代谢物S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸（DCVC）在巨噬细胞模型中诱导免疫抑制的分子机制及其对妊娠健康的潜在威胁。研究证实，亚细胞毒性浓度的DCVC（1-5 μM）能剂量依赖性地显著抑制脂多糖（LPS）、脂磷壁酸（LTA）和酵母聚糖（zymosan）刺激的巨噬细胞促炎细胞因子（TNFα, IL-1β, IL-18）释放。基准剂量（BMD）建模显示，其对TNFα/IL-1β的抑制作用（BMD 0.13-0.42 μM）远早于细胞毒性反应（BMD 24.17 μM），表明免疫抑制是更敏感的毒性终点。转录组分析进一步发现DCVC通过调控NF-κB、维生素D受体（VDR）和CEBPD等关键转录因子，并下调吞噬作用（如TNF, TLR7, SYT7, SELE）相关基因的表达，从而广泛抑制巨噬细胞的免疫防御功能。该免疫抑制效应可能破坏妊娠期免疫稳态平衡，增加宫内感染风险，为理解TCE暴露相关的妊娠不良结局（如早产、感染）提供了重要的分子病理学依据。

　　

引言：环境污染物与妊娠免疫风险

环境毒物可通过增强或抑制免疫反应干扰宿主防御，增加人群感染易感性。三氯乙烯（TCE）作为广泛使用的工业溶剂（如金属脱脂剂），其环境释放量巨大（美国2017年释放约200万磅），人群可通过吸入蒸气、饮水摄入或皮肤接触暴露。TCE在体内主要经细胞色素P450氧化和谷胱甘肽（GSH）结合两条途径代谢。谷胱甘肽结合途径生成S-(1,2-二氯乙烯基)-谷胱甘肽（DCVG），进而转化为高活性代谢物S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸（DCVC）。研究表明，TCE及其代谢物具有免疫毒性，且能透过胎盘屏障，而妊娠期免疫系统需在抵御病原体与耐受胎儿间维持精密平衡。巨噬细胞作为胎膜、胎盘等妊娠组织中的关键免疫细胞，其抗微生物功能（如吞噬、细胞因子释放）对防止宫内感染至关重要。前期研究发现DCVC（而非另一代谢物三氯乙酸TCA）能抑制胎膜组织对B族链球菌的促炎反应，但其对巨噬细胞免疫功能的具体影响及机制尚不清楚。

材料与方法：体外模型与多组学分析

本研究结合THP-1巨噬细胞模型实验与生物信息学分析：

1. 实验设计： 采用PMA分化的THP-1细胞模拟妊娠相关巨噬细胞功能。

2. 细胞毒性： 使用LDH释放实验评估不同浓度DCVC（1-500 μM）处理24小时后的细胞毒性。

3. 免疫抑制评估： 细胞经DCVC（0.001-5 μM）预处理20小时后，分别用三种病原体相关分子模式（PAMP）刺激4小时：LPS（革兰阴性菌，TLR4激动剂，100 ng/ml）、LTA（革兰阳性菌，TLR2激动剂，1 μg/ml）、zymosan（真菌，dectin-1/TLR2,6激动剂，1 μg/ml）。随后检测上清液中TNFα, IL-1β, IL-6, IL-18, IFNα, CD163水平（Luminex多因子检测）。

4. 基准剂量模型： 使用EPA BMDS 3.2软件，以对照组均值1个标准差为基准反应（BMR），拟合DCVC对TNFα/IL-1β释放抑制及细胞毒性的剂量反应曲线，计算基准浓度（BMC）。

5. 转录组分析：

   • 转录因子富集： 基于已发表的THP-1细胞转录组数据集（GSE183141），分析DCVC (5 μM) ± LPS (100 ng/ml) 处理后的差异表达基因（DEGs，FDR<0.05, |log2FC|>2.5）。使用ENRICHR平台（TRRUST数据库）鉴定各处理组（DCVC vs Control, LPS vs Control, DCVC+LPS vs Control, DCVC+LPS vs LPS）显著富集的转录因子。

   • 吞噬作用基因分析： 聚焦“吞噬作用”GO父项下的子项（识别GO:0006910、吞噬GO:0006911、吞噬溶酶体组装GO:0001845、吞噬体成熟GO:0090382），提取DCVC+LPS vs LPS组中显著差异表达的吞噬相关基因并绘制热图。

结果：DCVC的广泛免疫抑制与分子机制

1. 细胞毒性： DCVC在50 μM及以上浓度引起THP-1细胞显著LDH释放，20 μM及以下无显著毒性，故后续免疫实验使用≤5 μM浓度。

2. 多PAMP刺激下的免疫抑制：

   • DCVC剂量依赖性显著抑制所有三种PAMP（LPS, LTA, zymosan）刺激的TNFα释放（1 & 5 μM显著）。

   • DCVC剂量依赖性显著抑制LPS和LTA刺激的IL-1β释放（1 & 5 μM显著），以及zymosan刺激的IL-1β释放（5 μM显著）。

   • DCVC剂量依赖性显著抑制LPS和LTA刺激的IL-18释放（1 & 5 μM显著），对zymosan刺激的IL-18无显著影响。

   • DCVC剂量依赖性显著抑制LPS刺激的CD163释放（1 & 5 μM显著），对LTA和zymosan刺激的CD163影响不一致。

   • DCVC对IL-6和IFNα释放无显著影响。

3. 基准剂量模型揭示高敏感性：

   • TNFα抑制的BMC：LPS (0.21 μM), LTA (0.20 μM), zymosan (0.22 μM)。

   • IL-1β抑制的BMC：LPS (0.13 μM), LTA (0.35 μM), zymosan (0.42 μM)。

   • 无免疫刺激时，DCVC抑制基础TNFα/IL-1β释放的BMC更低（分别为0.0008 μM和0.0006 μM）。

   • 关键对比： DCVC细胞毒性的BMC为24.17 μM，远高于其抑制细胞因子释放的BMC（0.13-0.42 μM），表明免疫抑制是比细胞毒性更敏感的毒性终点。

4. 转录因子调控网络：

   • DCVC处理（无论有无LPS）均显著富集NF-κB1和RELA等核心炎症转录因子。DCVC下调了其靶基因（如TNF, IL1B, IL12B, IL18, IL6）。

   • DCVC特异性（DCVC+LPS组富集而LPS组未富集）调控的关键转录因子包括：CEBPD, VDR, TRERF1, EGR1。

   • 仅DCVC处理（无LPS）富集的转录因子包括：EPAS1, MITF, NFATC2, RUNX2, TP53。

5. 吞噬作用基因下调： DCVC+LPS处理相较于LPS单独处理，显著下调涉及吞噬作用各关键步骤的基因，例如：识别（TNF, TLR7）、吞噬（SYT7）、吞噬溶酶体组装/成熟（SELE）。TNF (log2FC = -3.49), TLR7 (log2FC = -4.42), SYT7 (log2FC = -4.77), SELE (log2FC = -4.02)。

讨论：妊娠健康意义与未来方向

本研究首次系统阐明DCVC在巨噬细胞中引发广泛免疫抑制的剂量效应与分子机制：

1. 广泛免疫抑制效应： DCVC对由TLR4 (LPS)、TLR2 (LTA)、dectin-1/TLR2,6 (zymosan) 不同受体通路引发的炎症反应均产生显著抑制，表明其免疫抑制具有广谱性，可能增加接触人群对多种宫内病原体（如大肠杆菌、GBS、念珠菌）的易感性。

2. 高敏感性： BMC模型明确显示，DCVC抑制关键促炎细胞因子（TNFα, IL-1β）的效力（BMC 0.13-0.42 μM）远高于其细胞毒性（BMC 24.17 μM），且该浓度（≤5 μM）与职业暴露于TCE限值（100 ppm）人群血中测得的DCVG浓度（~13.4 μM）接近，提示其免疫抑制效应在环境相关暴露水平下即可发生。

3. 分子机制深度解析：

   • 转录因子网络失调： DCVC通过调控NF-κB、VDR、CEBPD、EGR1、TR