视紫红质结构解析：揭示无视网膜结合的Flotillin相关视紫红质（FAR）的分子机制与功能意义

这篇研究通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了海洋细菌Pseudothioglobus中flotillin相关视紫红质（FAR）及其视网膜结合旁系同源物（PR）的结构，首次揭示FAR通过H84和E120两个关键氨基酸占据视网膜结合位点的独特机制。研究发现尽管缺乏视网膜辅因子，FAR仍保持典型微生物视紫红质（MR）的七次跨膜螺旋结构和同源五聚体组装模式，并通过双位点突变（H84V/E120G）成功恢复视网膜结合能力。该工作为理解微生物视紫红质自然丢失视网膜的进化机制提供了结构基础，对探索非典型视紫红质的功能具有重要意义。

　　

Structural basis for no retinal binding in flotillin-associated rhodopsins

微生物视紫红质（MR）作为光敏感膜蛋白，通过共价结合的视网膜辅因子实现太阳能捕获与能量转换。近期发现的flotillin相关视紫红质（FAR）虽保留典型视紫红质结构特征，却表现出独特的视网膜结合缺失现象。这项研究通过高分辨率冷冻电镜技术，首次揭示了这一特殊现象的分子基础。

功能与结构表征
研究团队选取海洋γ-变形菌Pseudothioglobus中的FAR（PsFAR）及其旁系同源物PR（PsPR）进行对比分析。光谱分析显示PsPR具有典型视紫红质特征：最大吸收波长512nm，pK_a≈5.1的质子泵活性。而PsFAR尽管在表达纯化过程中添加过量全反式视网膜，仍保持无色状态，证实其视网膜结合能力缺失。

冷冻电镜结构解析获得2.5?分辨率的三维结构，揭示PsFAR与PsPR具有62%序列相似性，均形成经典的五聚体组装。引人注目的是，PsFAR虽保留第七跨膜螺旋（helix G）上保守的K213残基，但其视网膜结合口袋（RBP）被H84和E120的侧链完全占据。H84通过氢键网络稳定在视网膜多烯链位置，E120则占据β-紫罗兰酮环空间，二者协同作用导致结合口袋体积缩减60%。

结构保守性与功能适应性
令人惊讶的是，缺乏视网膜的PsFAR仍保持完整MR折叠特征：七次跨膜螺旋（A-G）的空间排布与典型视紫红质高度一致，包括中央区域的赖氨酸定位和羧酸反离子网络。五聚体界面分析显示，PsFAR通过Y60'-S19氢键维持亚基相互作用，其中心孔径（10?）较PsPR（20?）显著缩小。

跨膜螺旋E在PsFAR中向分子中心位移2?，进一步压缩β-紫罗兰酮环空间。胞质区helix G延长12?形成突出结构域，暗示其可能与flotillin相互作用的潜在位点。这些精细的结构差异为理解非典型视紫红质的功能演化提供了重要线索。

视网膜结合恢复实验
通过系统突变研究，团队发现仅当同时将H84V和E120G双突变（PsFAR-DM）时，才能恢复视网膜结合能力。单突变体均无法实现这一功能，证实两个位点的协同阻断机制。2.8?冷冻电镜结构显示，PsFAR-DM中视网膜以全反式构象共价连接K213，伴随Y183/P184位移1.9?为多烯链腾出空间。

光谱分析显示突变体最大吸收波长蓝移至498nm（pK_a≈4），飞秒瞬态吸收光谱揭示其光动力学特征与典型MR存在差异：J态缺失，激发态吸收（ESA）和受激发射（SE）信号持续至10ps。持续光照实验观察到375nm的M态中间体积累，反映胞质侧质子供体缺失导致的RSB再质子化障碍。

生物学意义与展望
该研究首次在原子水平阐明微生物视紫红质自然丢失视网膜的结构机制。H84和E120构成的"分子塞"机制，为理解MR功能多样性提供了新视角。特别值得注意的是，尽管丧失光敏功能，PsFAR仍严格保守典型视紫红质折叠，暗示其可能演化出与flotillin相互作用的新功能。

结构比较显示PsFAR与蓝色变形菌视紫红质（BPR）具有更高相似性，其helix E构象变化和胞质区延伸可能参与蛋白-蛋白相互作用。这些发现为后续研究FAR-flotillin复合物的组装机制和生理功能奠定了重要基础。

从技术角度看，该工作展示了冷冻电镜在解析膜蛋白精细结构方面的强大能力，2.5-2.8?分辨率足以辨别关键水分子网络和氨基酸侧链取向。研究建立的视网膜结合恢复策略，也为设计新型光遗传学工具提供了分子模板。

这项研究不仅拓展了对非典型视紫红质的结构认知，更为理解膜蛋白功能演化提供了范例。未来研究将聚焦于解析天然FAR-flotillin复合物结构，揭示这类特殊视紫红质在细菌信号转导或膜组织中的生物学角色。