现场捕获蚊虫垂直传播揭示乌苏图病毒在温带国家定植机制

《Scientific Reports》：Vertical transmission in field-caught mosquitoes identifies a mechanism for the establishment of Usutu virus in a temperate country

本研究针对乌苏图病毒（USUV）如何在温带地区（如英国）越冬并建立地方性流行的关键科学问题，通过2021-2024年在伦敦动物园的增强媒介监测，首次在野外捕获的幼虫羽化成虫中检测到USUV RNA，证实了其在媒介库蚊（Culex pipiens s.l.）中的垂直传播，为理解新发虫媒病毒在温带地区的持久存续机制提供了重要证据。

　　

随着全球气候变化的加剧，曾经被认为相对安全的温带地区，正面临着来自热带和亚热带地区虫媒传染病日益增长的威胁。乌苏图病毒（Usutu virus, USUV）作为一种新发的人兽共患黄病毒（flavivirus），近几十年来在欧洲大陆迅速传播，并于2020年首次在英国确认发现。令人关注的是，在首次检测到该病毒后的连续几年中，USUV在英国被反复检出，这表明病毒能够在当地越冬，并应被视为已在英格兰东南部形成地方性流行。然而，仅靠对鸟类宿主和蚊子媒介的常规监测，难以阐明USUV如何在这种冬季寒冷、不适宜病毒活跃传播的温带气候中存续下来的具体机制。病毒是通过在鸟类宿主中持续感染或复发，还是依赖蚊子媒介的特殊生理状态（如滞育）或繁殖方式（如垂直传播）来度过寒冬？这一科学问题的解答，对于评估USUV对动物和公共卫生的潜在风险至关重要。

为了深入探究USUV在英国定植的驱动因素，一个研究团队在2020年病毒首次暴发的原始地点——伦敦动物园，开展了为期四年（2021年至2024年）的针对性媒介监测。这项研究旨在通过增强的监测策略，揭示病毒在媒介种群中的动态，特别是其越冬机制。研究成果最终发表在《Scientific Reports》期刊上。

研究人员采用了多项关键技术方法来开展此项研究。首先是增强媒介监测，这包括三个部分：（1）使用BG-Sentinel 2?诱捕器采集成年雌蚊，以了解病毒传播情况；（2）在冬季使用机械式吸蚊器从越冬场所（如混凝土泵房和储藏室）收集滞育的成年蚊子，并将其在实验室条件下（25°C, 50%湿度，12:12光周期）饲养一段时间，以期激活潜在的病毒复制；（3）从野外水体或设立的产卵陷阱中采集蚊子幼虫（L1和L2阶段），在实验室昆虫房内将其饲养至成虫，以调查垂直传播的可能性。其次，对收集到的蚊子进行形态学鉴定，由于库蚊属（Culex pipiens）和托氏库蚊（Culex torrentium）的雌虫难以通过形态区分，研究中将其统称为库蚊复合体（Culex pipiens s.l.）。第三，运用分子生物学技术进行病毒检测，将蚊子以不超过10只为单位分成池，匀浆后使用TRIzol?法提取总RNA，并通过USUV特异性的RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）进行筛查。对于PCR阳性的样本，尝试在BSL3（生物安全三级）实验室使用Vero细胞进行病毒分离。此外，还对部分阳性样本进行了下一代测序，以获取病毒基因组序列并进行系统发育分析，追溯病毒来源。最后，通过对吸血蚊子的血餐分析，利用细胞色素c氧化酶I（COX1）基因测序来鉴定蚊子吸食的宿主来源，以了解潜在的传播网络。

增强媒介监测提高了蚊虫中USUV的检出率

研究结果显示，在2022年和2023年的蚊子活跃季节，分别捕获了156只和5433只成年蚊子，其中绝大多数（92.0%）为库蚊复合体。2022年检测的55个蚊池中，有2个池（3.6%）在9月份采集的样本中USUV RNA呈阳性。2023年，检测的540个蚊池中有6个池（1%）呈阳性，这些阳性样本均来自8月份采集的蚊子。基于每池10只蚊子的估算，这两年的最低感染率分别为0.36%和0.1%。所有USUV RNA阳性的蚊池均属于库蚊复合体。血餐分析成功从16只吸血蚊中的4只鉴定出鸟类宿主，包括南美卡拉卡拉鹰（Caracara plancus）、灰顶翠鸠（Chalcophaps indica）和美洲红鹮（Eudocimus ruber），这些均是伦敦动物园户外饲养的鸟类，表明当地库蚊主要以鸟类为食。

尝试采用改良方案检测滞育雌蚊中的USUV

在2021/22、2022/23和2023/24年冬季，共收集了1950只滞育雌蚊，其中99.5%为库蚊复合体。然而，对这三年冬季收集的所有242个蚊池进行检测，USUV RNA均为阴性。研究人员尝试在实验室模拟夏季条件下饲养这些越冬蚊，以期激活病毒复制，但即使调整了检测时间点（在采集后10天和3周进行检测），也未能检测到病毒。

垂直传播有助于USUV在库蚊复合体中的持久存续

这是本研究最重要的发现之一。2023年6月，研究人员从野外采集的幼虫（L1和L2阶段）成功羽化出1297只成年蚊子。其中一个池（包含2只雄蚊）的USUV RNA检测呈阳性。这2只雄蚊是来自幼虫的羽化成虫，其幼虫采集自伦敦动物园的中心区域。这一发现强烈提示了USUV在媒介中的垂直传播，即病毒通过受感染的雌蚊卵传递给下一代。虽然未能从该阳性池的匀浆液中成功分离出活病毒，但通过下一代测序获得了一段5210 bp的病毒序列，该序列与USUV非洲谱系3.2型（Africa lineage 3.2）参考基因组高度同源。系统发育分析显示，这个来自垂直传播的序列与同年从成年蚊中获得的另一个USUV序列共同聚集在USUV非洲谱系3.2型的英国分支内，证实了它们在当地的传播关联。

综合以上研究结果，可以得出结论：通过增强的、针对不同生命阶段的媒介监测，本研究不仅再次证实了USUV在活跃季节于成年库蚊复合体中的循环，更重要的是，首次提供了USUV在节肢动物媒介（库蚊复合体）中存在垂直传播的现场证据。这一发现具有里程碑式的意义。

在讨论中，研究人员指出，尽管在病毒活跃的原始地点存在较高的病毒暴露迹象（如发现感染USUV的死亡野鸟和动物园鸟类血清阳转），但在蚊子群体中通过RT-qPCR检测到的USUV RNA流行率仍然较低，这与欧洲大陆其他USUV流行区的观察结果一致。这可能反映了病毒在媒介体内滴度自然较低的现实。垂直传播，虽然在野外样本中通常检测率不高，但被认为是黄病毒在不适宜气候条件下或缺乏脊椎动物宿主时的一种潜在持久存续机制。本研究证实了USUV也存在这一机制，这意味着病毒可以在蚊子种群内部传播，而不完全依赖于鸟类的活动，这很可能是在温带地区建立地方性流行的关键机制之一。研究人员推测，在6月份从幼虫中检测到垂直传播，可能间接暗示了病毒通过越冬蚊产下的卵进行了传递。

虽然本研究未能在越冬的滞育成蚊中检测到USUV，但这并不排除病毒通过滞育成虫越冬的可能性，可能由于病毒滴度过低或实验条件未能充分模拟自然复苏过程。未来的研究可进一步探索病毒在滞育蚊体内的维持和激活机制。

总之，这项研究强调了增强媒介监测对于理解虫媒病毒疾病生态学和流行病学的重要价值。随着黄病毒在欧洲的持续扩散，明确其定植机制，特别是像垂直传播这样的关键环节，对于预测风险、制定有针对性的媒介控制策略以保障人类和动物健康至关重要。本研究为应对新发虫媒病毒在气候变化背景下的挑战提供了重要的科学依据。