BiP-GRP94分子伴侣复合体的构象可塑性揭示分泌途径中蛋白质质量控制新机制

本研究揭示了内质网Hsp70(BiP)与Hsp90(GRP94)分子伴侣直接协作的分子机制。研究人员通过结构生物学和生物化学方法，首次解析了BiP-GRP94复合体的预装载和装载两种构象状态，阐明了无辅助伴侣参与下Hsp70-Hsp90协同作用的基本原理，为理解分泌途径中蛋白质折叠质量控制提供了重要见解。

　　

在真核细胞的蛋白质质量控制系统中，分子伴侣扮演着至关重要的角色。其中，内质网中的BiP(属于Hsp70家族)和GRP94(唯一的内质网Hsp90同源蛋白)是分泌途径中蛋白质折叠和质量监控的关键分子。然而，与细胞质中Hsp70-Hsp90系统依赖辅助伴侣Hop不同，内质网中这两种分子伴侣如何直接协作完成底物传递一直是个未解之谜。这个问题的解答对于理解分泌蛋白和膜蛋白的成熟过程具有重要意义，也与多种疾病的发生发展密切相关。

来自德国杜伊斯堡-埃森大学(Universit?t Duisburg-Essen)的研究团队在《Nature Structural & Molecular Biology》发表了这项突破性研究。研究人员综合利用负染色电镜、交联质谱(XL-MS)和生物化学方法，首次捕捉到了BiP-GRP94复合体的两种关键构象状态，揭示了无辅助伴侣参与下Hsp70-Hsp90直接协作的分子机制。

研究采用了多项关键技术：1)利用疏水标记技术(HyT36)诱导HaloTag2(HT2)错误折叠作为模型底物；2)通过交联质谱(XL-MS)分析BiP-GRP94相互作用界面；3)采用梯度固定(GraFix)结合负染色电镜解析复合体结构；4)构建系列突变体验证关键相互作用位点；5)通过圆二色谱(CD)和有限蛋白酶解验证底物折叠状态。

研究结果部分：

Conformational plasticity of a BiP-GRP94 chaperone complex

研究发现BiP能够直接与开放的GRP94二聚体结合形成"预装载复合体"，随后第二个BiP分子的结合促使GRP94转变为半闭合构象的"装载复合体"。这种构象变化不依赖任何辅助伴侣，揭示了内质网中Hsp70-Hsp90系统独特的协作机制。

A stable complex between BiP and GRP94

生化实验表明，GRP94抑制剂PU-WS13促进BiP-GRP94复合体形成，而促使GRP94完全闭合的AMP-PNP则抑制这一相互作用，说明GRP94的开放/半闭合构象是BiP结合的必要条件。

Assessing the topology of a BiP-GRP94 complex by crosslinking mass spectrometry

交联质谱鉴定出两个保守的相互作用界面：界面I涉及GRP94_MD螺旋与BiP_NBDIIA叶的结合；界面II则与GRP94_NTD构象变化相关。这些界面在进化上高度保守，提示了Hsp70-Hsp90协作的基本原理。

Hydrophobic tagging to establish a BiP-GRP94-substrate complex

研究人员创新性地利用疏水标记技术，在体外重建了分子伴侣-底物复合体。实验证实BiP和GRP94都能独立结合错误折叠的HT2，也能形成多伴侣复合体，为研究底物传递提供了新工具。

BiP binds to the open GRP94 dimer in the preloading complex

负染色电镜首次解析了预装载复合体的结构，显示单个BiP分子通过界面I与开放的GRP94二聚体结合，此时GRP94保持典型的"扭曲V"形构象。

BiP bound to a semiclosed GRP94 conformation

在装载复合体结构中，两个BiP分子协同作用稳定了GRP94的半闭合构象。这种构象与细胞质Hsp70-Hsp90-Hop装载复合体惊人相似，尽管内质网系统中完全缺乏Hop类辅助伴侣。

BiP_NBD-GRP94 interactions in preloading and loading complex

关键残基突变实验证实，界面I的破坏(E243K/K467E)几乎完全消除BiP-GRP94相互作用，而界面II突变(R116G)仅部分影响复合体稳定性，说明两个界面在不同构象转变阶段发挥不同作用。

这项研究的重要意义在于：首先，它揭示了内质网中Hsp70-Hsp90系统直接协作的分子基础，填补了分泌途径蛋白质质量控制机制的关键空白；其次，发现的保守相互作用界面为理解不同物种和细胞区室中分子伴侣系统的进化提供了新视角；再者，开发的疏水标记技术为研究分子伴侣-底物相互作用提供了新方法；最后，GRP94构象调控机制的阐明为开发针对分泌途径相关疾病的特异性药物提供了理论依据。

特别值得注意的是，这项研究展示了一个精巧的分子伴侣协作"舞蹈"：BiP首先作为"引路人"通过界面I识别开放的GRP94，随后第二个BiP分子的加入如同"构象开关"，促使GRP94转变为底物装载状态。这种不依赖辅助伴侣的协作模式，可能反映了分泌系统中蛋白质质量控制的高效性和特异性需求。这些发现不仅深化了对基本细胞过程的理解，也为相关疾病的治疗策略开发提供了新思路。