小麦根际假单胞菌实验进化揭示fleN基因点突变驱动鞭毛适应性优化与定植能力提升

本文通过实验进化方法，系统探究了假单胞菌（Pseudomonas）在小麦根际的适应性演化过程，揭示fleN基因点突变精细调控鞭毛数量，显著增强细菌运动性和定植能力，为植物生长促进根际细菌（PGPR）的农业应用提供了关键机制见解。该研究首次建立小麦根际进化模型，追踪基因组动态变化，突显鞭毛表型在微生物-植物互作中的核心作用。

　　

引言

植物根际是微生物与植物互作的关键界面，其中植物生长促进根际细菌（PGPR）的定植能力直接影响其生物防治效能。假单胞菌（Pseudomonas）作为重要PGPR代表，通过长期进化适应根际环境，但调控其适应性突变的分子机制尚未充分解析。本文以Pseudomonas bijieensis 2P24（曾名Pseudomonas fluorescens 2P24）为模型，建立小麦根际实验进化系统，模拟自然演化过程，追踪细菌在碳限制条件下的基因组动态变化，旨在揭示根际定植的遗传基础。

结果

小麦根际中Pseudomonas bijieensis 2P24的实验适应性进化

通过连续传代实验（SPEs），在无菌、无碳源的Murashige和Skoog（MS）培养基中构建进化系统，模拟小麦根际环境。初始接种约10⁵ CFU的2P24祖先菌株于小麦种子，每10天为一个生长周期，共进行8个周期（80天），覆盖约297代进化。设置四个独立进化系（line 1-4），确保选择性压力仅源于植物根系。细菌种群密度在初期达10⁸ CFU，20天后稳定于10⁷ CFU水平，表明种群适应根际环境并建立生态平衡。进化过程中，细菌种群通过标准化接种量维持，避免人为干扰，证实适应性突变的自然发生。

小麦根际80天适应性定植中的基因组变异

利用全基因组测序和单核苷酸多态性（SNP）分析，监测四个进化系在20、40、60和80天（周期2、4、6、8）的群体样本。深度测序覆盖>300×，比对祖先基因组（NCBI RefSeq: GCF_002865505.1）揭示七个高频SNP位点。突变在进化20天后出现并积累，其中fleN基因在四个系中均发生点突变，频率高达49%。其他突变包括baeS、hisM和COJ56_RS12475基因，但仅出现于特定系（如hisM突变于line 2），表明随机事件或微环境差异影响。fleN突变呈现平行进化特征，暗示其在小麦根际定植中的核心作用。

fleN突变体在进化群体中积累，增强2P24在小麦根际的定植能力

fleN基因（编码鞭毛数量调控蛋白）的点突变在进化后期主导种群。构建人工突变体（FleN^R218C、FleN^L260R、FleN^V24L和FleN^A139V）验证表型：在单一定植实验中，突变体在小麦根际后期（接种后10天）定植密度显著高于祖先；竞争定植实验显示，突变体相对适应性提升2.1-4.6倍。进化分离株（如FleN^V24L-E1）定植优势略低于人工突变体，推测因长期进化中适应性状权衡。值得注意的是，FleN^V24L和FleN^A139V突变体在番茄根际亦表现增强适应性，表明跨宿主普适性。相较之下，baeS和hisM突变体无显著定植优势，证实fleN突变的特异性适应价值。

fleN突变在鞭毛表型及相关性状中的关键作用

透射电镜（TEM）分析显示，祖先菌株具1-3根鞭毛，而fleN敲除突变体（ΔfleN）呈超鞭毛表型（≥9根）。进化fleN点突变体鞭毛数中度增加至4-8根：FleN^R218C和FleN^V24L以5根为主，FleN^L260R和FleN^A139V以6根为主。表型检测表明，突变体在LB培养基上运动性（swarming motility）增强（FleN^L260R、FleN^V24L和FleN^A139V显著提升），但在均匀营养环境中FleN^R218C运动性未变，突显环境依赖性；在根际模拟条件下，所有突变体运动性均增强，支持其在根际远距离生态位占据优势。生物膜形成能力普遍降低，与鞭毛-生物膜权衡机制一致。生长曲线在LB培养基中无差异，表明定植优势源于鞭毛表型而非增殖能力。

fleN突变体通过降低对FleQ ATPase活性的抑制调控鞭毛数量

fleN编码的蛋白通过ATP依赖性二聚化抑制FleQ（细菌增强子结合蛋白）的ATPase活性，从而调控鞭毛基因转录。细菌双杂交实验证实，fleN点突变体（FleN^R218C等）二聚化能力显著降低，导致FleQ ATPase活性抑制减弱（残留活性56.4%-71.2%）。实时定量PCR（RT-qPCR）显示，突变体中fleS和fleR基因（鞭毛级联调控组分）转录水平升高，介于祖先与ΔfleN之间。分子机制表明，fleN突变通过减弱