Tussilagone通过靶向KEAP1的Cys434调控Nrf2/NF-κB/NLRP3通路缓解慢性阻塞性肺病的机制研究

本研究针对慢性阻塞性肺病（COPD）缺乏有效治疗靶点的难题，通过高通量筛选发现中药款冬花活性成分Tussilagone（TUS）能特异性结合KEAP1蛋白的Cys434位点，激活Nrf2通路并抑制NF-κB/NLRP3炎症小体，阐明了其通过"KEAP1-Nrf2-氧化应激/炎症"轴治疗COPD的新机制，为开发靶向Kelch结构域的新型Nrf2激活剂提供理论依据。

　　

慢性阻塞性肺病（COPD）作为全球第三大死因，其治疗面临严峻挑战。当前临床主要依赖糖皮质激素和支气管扩张剂，但存在疗效有限和副作用明显等问题。传统中药款冬花（Farfarae Flos）虽在汉朝就有治疗肺病的记载，其活性成分和作用机制却始终成谜。更关键的是，KEAP1-Nrf2通路作为细胞防御氧化损伤的核心调控系统，现有靶向该通路的药物多因脱靶毒性在临床试验中折戟。这些困境促使山东大学药学院的研究团队开展突破性探索，其成果发表在《Journal of Advanced Research》上。

研究团队采用高通量筛选结合生物素标记探针技术，从款冬花61种成分中锁定oplopanane型倍半萜Tussilagone（TUS）作为先导化合物。通过表面等离子共振（SPR）和药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）等技术验证靶点，并利用CRISPR-Cas9基因编辑构建Nrf2^-/-小鼠模型。临床样本分析采用COPD患者肺组织，动物实验使用C57BL/6N雄性小鼠建立香烟烟雾（CS）诱导的COPD模型。

【Discovery of TUS as a potent therapeutic agent for COPD】

研究发现TUS在20 μM浓度下可抑制68.1%的TNF-α分泌，显著改善CS诱导的小鼠肺泡融合和气道纤维化。支气管肺泡灌洗液（BALF）检测显示，TUS使表面活性蛋白D（SP-D）水平恢复至对照组85%，证实其肺保护作用。

【KEAP1 is the direct target of TUS】

创新设计的生物素化探针TUSP通过pull-down实验结合LC-MS/MS鉴定，发现TUS特异性结合KEAP1蛋白（K_D=35.2 μM）。分子对接揭示其酯基嵌入KEAP1亲水腔，与ARG415形成氢键。

【Cys434 is the crucial amino acid for the binding of TUS to KEAP1】

质谱检测到Cys434位点114.06 Da的质量偏移，点突变实验证实C434A突变完全废除TUS活性。这是首次发现Kelch结构域中Cys434的高反应性，将其归类为第五类KEAP1诱导剂。

【TUS activated Nrf2 pathway via binding to KEAP1】

TUS使Nrf2半衰期从14.5分钟延长至26.2分钟，核转位增加2.1倍。在Nrf2^-/-小鼠中，TUS的抗氧化和抗炎作用完全消失，证实其作用依赖Nrf2通路。

【TUS inhibited NF-κB by activating Nrf2】

20 μM TUS使核内p-NF-κB降低59.7%，且该效应在C434A突变细胞中被废除，证实KEAP1 Cys434是调控NF-κB的关键位点。

【TUS inhibited the activation of NLRP3 inflammasome by activating Nrf2】

TUS通过抑制ASC寡聚化阻断NLRP3炎症小体组装，使IL-1β分泌减少57.7%。添加ROS清除剂NAC可模拟该效应，证实其通过Nrf2介导的ROS清除发挥作用。

这项研究不仅阐明款冬花治疗COPD的科学内涵，更开创性地发现KEAP1 Kelch结构域Cys434的药物靶点价值。相较于靶向Cys151/273/288的现有药物，TUS展现更高的靶点特异性，为开发新一代Nrf2激活剂提供独特思路。值得注意的是，研究团队采用"成分-靶点-通路"多维验证策略，从传统中药中发现的首个Kelch结构域靶向化合物，为中药现代化研究提供范式。尽管小鼠实验显示TUS安全性良好，但研究者强调需进一步评估其与临床已获批Nrf2激活剂（如富马酸二甲酯）的协同效应，以及人体肺组织中的靶点结合效率差异。这些发现为COPD的精准治疗开辟新途径，也为其他慢性炎症性疾病治疗提供借鉴。