酿酒酵母Xrs2通过FHA结构域直接结合DNA的分子机制及其在双链断裂修复中的双重识别功能

推荐：本研究揭示了酿酒酵母Xrs2蛋白N端FHA结构域作为DNA和磷酸化蛋白（如pSae2）的双重结合平台，通过NMR化学位移扰动和顺磁弛豫增强等技术，建立了DNA-Xrs2325复合物的整合模型，阐明了MRN/X复合物在DNA双链断裂修复中协同作用的结构基础。

　　

DNA双链断裂是细胞最危险的DNA损伤形式之一，MRN/X（MRE11-RAD50-NBS1/Xrs2）复合物作为"第一反应者"在此过程中发挥核心作用。虽然MRE11和RAD50的DNA结合特性已被充分研究，但NBS1/Xrs2的DNA结合机制却长期是个谜团。这个谜题的破解对于理解染色体不稳定综合征（如共济失调毛细血管扩张样疾病）和癌症易感性的分子机制至关重要。

美国密歇根州立大学（Michigan State University）的研究团队在《Journal of Molecular Biology》发表的研究，首次揭示了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Xrs2蛋白通过其FHA结构域直接结合DNA的分子机制。研究人员采用甲基选择性核磁共振（NMR）技术，结合顺磁弛豫增强（PRE）和HADDOCK分子对接等方法，绘制出DNA与Xrs2³²⁵（1-325氨基酸片段）相互作用的精细图谱。

关键技术包括：甲基选择性核磁共振检测化学位移扰动（CSP）、顺磁标记DNA的顺磁弛豫增强（PRE）实验、HADDOCK分子对接建模、电泳迁移率变动分析（EMSA）验证结合位点，以及荧光偏振法测定磷酸化肽段结合活性。

【DNA binds to the FHA domain of Xrs2³²⁵】研究发现Xrs2³²⁵的FHA结构域是DNA主要结合位点。通过15bp发夹DNA滴定实验，检测到10Leu、18Ile等FHA结构域甲基基团的显著化学位移变化，结合常数K_D≈0.75 μM。PRE实验进一步证实，当PROXYL自旋标记位于DNA第2个核苷酸时产生最强顺磁效应，表明该区域最接近FHA结构域。

【Model of pSae2 bound to Xrs2³²⁵】研究发现磷酸化Sae2肽段（pSae2）与DNA竞争结合FHA结构域的相同正电区域。1Met、46Ile等甲基基团的CSP模式与DNA结合相似，K_D≈1.0 μM。这与裂殖酵母Nbs1-pCtp1复合物的晶体结构具有相似性，但结合取向存在差异。

【Validation of ligand-bound Xrs2³²⁵ structural models】通过电荷反转突变体验证了结合模型。EMSAs显示K35E和R48E突变完全破坏DNA结合，而K54E几乎无影响。荧光偏振实验证实R32E和R48E也显著削弱pSae2结合，但K35E和K73E表现出DNA结合特异性缺陷，揭示了部分功能分离的分子基础。

【Changes in Xrs2³²⁵ dynamics upon ligand binding】动力学分析显示，配体结合使FHA结构域在ps-ns时间尺度上刚性增强，但μs-ms尺度的构象交换不受影响。值得注意的是，BRCT1结构域中参与"精氨酸开关"的α螺旋（186Leu和207Met附近）表现出显著的构象交换，但该动态特性不随配体结合而改变。

这项研究首次阐明Xrs2/NBS1家族蛋白FHA结构域具有DNA结合能力，打破了该结构域仅识别磷酸化蛋白的传统认知。发现的DNA-pSae2竞争结合机制为理解MRN/X复合物在DNA损伤位点的动态组装提供了新视角。特别值得注意的是，K35E等分离功能突变体的发现，为后续研究DNA结合与磷酸化蛋白识别在DNA修复中的相对重要性提供了分子工具。这些发现不仅完善了DNA损伤应答的理论框架，也为开发靶向MRN/X复合物的抗癌药物提供了新的结构基础。