冷冻电镜驱动的可视化蛋白质组学揭示固氮细菌Azotobacter vinelandii中寡聚蛋白复合物的全新结构

本研究通过冷冻电镜（cryoEM）结合计算建模技术，解析了固氮细菌Azotobacter vinelandii在复杂细胞环境中天然存在的寡聚蛋白复合物结构。研究人员开发了三种自动化模型构建流程（CryoID/DeepTracer/ModelAngelo），成功鉴定了包括磷酸葡萄糖异构酶（Pgi1）十聚体、谷氨酰胺合成酶（GlnA）等6种独特结构，其中Pgi1和可溶性吡啶转氢酶（SthA）的寡聚状态为首次发现。该研究突破了传统结构生物学对纯化样品的依赖，为原位解析代谢酶的功能性组装体提供了新范式，相关成果发表于《Structure》。

　　

在生命科学领域，解析蛋白质的三维结构是理解其功能机制的关键。然而传统结构生物学方法需要高度纯化的样品，这可能导致天然存在的功能性寡聚体在纯化过程中解离。尤其对于固氮细菌Azotobacter vinelandii这类复杂体系，其代谢酶常以动态寡聚体形式发挥作用，但现有技术难以捕获这些天然组装状态。

加州理工学院（California Institute of Technology）的Yuanbo Shen和Rebeccah A. Warmack团队创新性地将冷冻电镜与计算建模相结合，开发了名为"可视化蛋白质组学"的研究策略。他们通过比较CryoID、DeepTracer和ModelAngelo三种自动化模型构建流程，直接从部分纯化的细菌提取物中鉴定了6种寡聚蛋白复合物，其中包括两个全新结构。这项突破性工作不仅揭示了代谢酶在天然状态下的组装规律，更为研究复杂生物体系中的蛋白质相互作用提供了新工具，相关成果发表在《Structure》期刊。

研究人员主要运用了三种关键技术：冷冻电镜单颗粒分析（分辨率达1.9-3.7 ?）解析蛋白结构；结合质谱技术鉴定共纯化蛋白成分；通过AlphaFold预测模型与实验数据的比对实现未知结构的鉴定。特别值得注意的是，研究团队还通过冷冻电子断层扫描（cryoET）在完整细胞中验证了部分结构的生理相关性。

可视化蛋白质组学管道的评估

研究团队首先在解析同源柠檬酸合成酶缺陷型氮酶MoFe蛋白（MoFe_ΔnifV）时，意外发现一个丰度较高的五重对称性未知结构。通过三种计算流程分析，最终确定其为磷酸葡萄糖异构酶1（Pgi1）形成的十聚体。这种由二聚体通过两个界面（界面A埋藏面积5950 ?²，界面B 1080 ?²）组装而成的五聚环结构，在2.5 ?分辨率下展现出独特的"螺丝"状构象变化（通过3DVA分析发现）。特别值得注意的是，ModelAngelo在8.4 ?分辨率下仍能准确识别该结构，展现了结构比对方法在低分辨率应用中的优势。

A. vinelandii Pgi1结构的构象状态

Pgi1十聚体表现出显著的结构动态性。三维变异性分析显示，其五聚环结构可发生平面外位移，形成右手螺旋构象。两个参与界面B相互作用的单体密度减弱，暗示该区域可能作为构象变化的"铰链"。序列比对发现界面B的保守性（18%）远低于界面A（45%），这可能解释了该物种特异性组装方式的演化基础。

无需先验蛋白质组学信息的蛋白鉴定

在解析祖先型氮酶MoFe_Anc1B时，研究人员发现共纯化的六重对称性蛋白。通过将DeepTracer模型与4,968个A. vinelandii的AlphaFold预测结构比对，成功鉴定为谷氨酰胺合成酶（GlnA）。这种不依赖质谱数据的鉴定方法，拓展了可视化蛋白质组学的应用范围。

可视化蛋白质组学在纤维状结构中的应用

通过cryoET在固氮条件下的A. vinelandii细胞内观察到未知纤维束。体外分离后，利用螺旋重建技术解析出三种纤维结构：鞭毛蛋白（FliC，2.82 ?）、Type VI分泌系统非收缩鞘管蛋白（TssC，1.85 ?）和可溶性吡啶转氢酶（SthA，3.70 ?）。其中SthA形成的螺旋纤维（每圈38 ?上升，-108°扭转）通过四个界面（α-3251.9 ?²，β-1823.3 ?²）组装，其FAD辅因子的表面可及性暗示了寡聚状态可能参与NAD(P)H平衡调控。

这项研究通过冷冻电镜驱动的可视化蛋白质组学，揭示了固氮细菌代谢酶在天然状态下的组装规律。特别重要的是：1）发现Pgi1十聚体和SthA纤维两种全新寡聚形式；2）证实结构比对方法在中等分辨率（<8.4 ?）下的可靠性；3）建立了不依赖纯化的原位结构解析流程。这些发现不仅为理解固氮细菌的代谢调控提供了结构基础，更发展了一套适用于复杂生物体系的结构研究范式。Type VI分泌系统与固氮基因簇的基因组共定位现象，以及ΔTssIJ突变株在缺氮条件下的生长缺陷，进一步暗示了这些结构组装体在环境适应中的重要作用。该研究为探索其他复杂体系中蛋白质的天然相互作用网络提供了方法论借鉴。