单细胞磷酸化信号与转录组整合分析揭示Th17细胞命运决定的新机制

本研究通过创新的Vivo-seq技术平台，首次在单细胞水平整合转录组与磷酸化信号分析，揭示了Th17细胞分化过程中ERK1/2和c-FOS协同磷酸化通过促进IL-2产生决定细胞命运的分子机制。该研究开发了基于深共晶溶剂(DES)的固定方法，解决了传统单细胞测序无法捕获磷酸化信号的技术瓶颈，为免疫细胞分化研究提供了新范式。

　　

免疫系统中，T辅助17细胞(Th17)的分化与功能调控一直是研究热点。这些细胞在抵御胞外病原体感染中发挥关键作用，但其异常活化也与多种自身免疫疾病密切相关。传统研究面临重大技术瓶颈——虽然单细胞RNA测序(scRNA-seq)能大规模解析转录组，却无法捕捉关键的磷酸化信号这种瞬时且动态的分子事件。这种信息断层严重限制了人们对免疫细胞分化机制的理解，特别是对于Th17这种具有高度可塑性的细胞亚群。

来自阿拉巴马大学伯明翰分校(University of Alabama at Birmingham, UAB)的Seth D. Fortmann团队开发了革命性的Vivo-seq技术平台。通过深共晶溶剂(DES)固定方法，首次实现了单细胞水平磷酸化信号与转录组的平行检测。研究发现Th17细胞中ERK1/2和c-FOS的协同磷酸化创造了"超活化"状态，这种双重磷酸化对IL-2的最大化产生不可或缺。更令人惊讶的是，早期IL-2的产生会"印记"Th17细胞，决定其在后续抗原刺激中的稳定性或转分化命运。这项突破性成果发表在《Cell Reports》期刊。

研究团队运用了多项关键技术：1) 基于vivoPHIX的DES固定技术，可同时保存RNA、蛋白质和磷酸化修饰；2) 优化的细胞内CITE-seq(inCITE-seq)方案，实现对4种磷酸化蛋白(p-ERK1/2、p-FOS、p-STAT3和p-p65)的单细胞检测；3) IL-2.eGFP报告小鼠模型追踪细胞命运；4) Th17细胞体外极化培养系统；5) 流式细胞术验证关键发现。

"DES固定实现多组学信息保存"部分显示，与传统甲醛/甲醇固定相比，DES固定不仅保持RNA完整性(RIN>8)，还能准确保留磷酸化信号。免疫印迹证实DES固定骨髓细胞中磷酸苏氨酸信号显著增强。流式分析显示DES与标准方法在IL-17A检测上高度相关(R²=0.955)。

"磷酸化信号与转录组关联分析"揭示，p-ERK1/2⁺细胞中IL-2表达最高，且与p-ERK1/2水平正相关。差异基因分析发现p-ERK1/2⁺/p-FOS⁺双阳性细胞独特高表达IL17a、IL17f、Tnf等效应分子，而低表达Tcf7等静息标志物。这种"超活化"状态需要ERK1/2和c-FOS双重磷酸化，AUM基因沉默实验证实同时敲低两者对IL-2/IL-17A产生的抑制最强。

"IL-2产生决定细胞命运"部分通过IL-2.eGFP⁺细胞分选和共培养实验证明，早期产生IL-2的Th17细胞在再次刺激时：1) 在TGF-β+IL-6条件下维持更高IL-17产量；2) 在IL-12刺激下更易转分化为IFN-γ⁺ Th1样细胞；3) 在体内结肠炎模型中显示出更强的存活和转分化能力。

这项研究在方法学和应用层面均取得重要突破。技术层面，Vivo-seq首次实现单细胞磷酸化信号与转录组的真正整合，克服了传统方法依赖"桥接整合"的局限。生物学层面，阐明了Th17细胞中IL-2产生的上游调控机制及其下游功能影响，为理解自身免疫疾病中Th17细胞的可塑性提供了新视角。特别值得注意的是，研究发现TCR/共刺激信号(通过ERK1/2-c-FOS)而非细胞因子信号(STATs)主导了IL-2的产生，这种信号层级为靶向干预Th17细胞功能提供了精确切入点。未来，这种多组学整合策略可广泛应用于免疫细胞信号网络研究，而ERK1/2-c-FOS-IL-2轴可能成为Th17相关疾病治疗的新靶标。