正黄病毒蛋白酶活性的亚细胞决定因素：内质网亚域定位与膜邻近性调控切割效率的分子机制

为解决正黄病毒(Orthoflavivirus)蛋白酶切割效率的分子机制问题，研究人员通过荧光报告系统揭示了内质网(ER)亚域定位和底物切割位点膜邻近性是两个全新分子决定因素，并发现NS4A|2K连接处低效切割对病毒存活至关重要，为抗病毒靶点设计提供了新思路。

　　

在全球范围内，由登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)等正黄病毒(Orthoflavivirus)引发的感染每年超过5亿例，却缺乏有效抗病毒治疗手段。这类病毒依赖NS2B-NS3蛋白酶(NS2B3)切割多蛋白产生功能亚基，但为何临床靶向该蛋白酶的抑制剂屡屡失败？谜底可能藏在蛋白酶切割效率的时空调控中。

研究人员构建了革命性的荧光报告系统FlavER（黄病毒蛋白酶活性报告系统），通过融合核定位信号(NLS)和可互换的蛋白酶识别基序，首次实现活细胞内切割事件的实时观测。该系统结合分子建模、亚细胞定位工程和感染性克隆突变，揭示了三个关键发现：

关键技术包括：（1）基于荧光蛋白-NLS-跨膜域(TM)模块的ER定位报告系统构建；（2）AlphaFold3模拟NS2B-NS3-NS4A多蛋白膜锚定结构；（3）双荧光标记活细胞延时成像定量切割动力学；（4）DENV/ZIKV感染性克隆的位点定向突变。

ER膜邻近性决定切割效率

通过插入甘氨酸-丝氨酸柔性接头延长切割位点与TM域距离，发现当间隔从8个氨基酸增至17个时，DENV蛋白酶切割效率显著降低（p<0.0001）。这解释了为何天然多蛋白中多数切割位点距离TM域<10个氨基酸。

ER片层结构偏好性

将报告基因分别锚定于ER管状结构（Rtn4a融合）和片层结构（SigmaR1融合）后，仅片层定位的报告蛋白在感染中出现核转位，与病毒复制复合体偏好ER片层的现象一致。

NS4A|2K切割的进化保守延迟

比较7个多蛋白切割位点发现，所有测试病毒（DENV/ZIKV/WNV/YFV）的NS4A|2K连接处（如DENV的KQR|TPQ）都是切割效率最低的位点（p<0.001）。活细胞成像显示其切割比衣壳位点（RRR|SAG）延迟约4小时（HPI₅₀=17h vs 13h）。

切割时序决定病毒命运

将DENV NS4A|2K天然序列突变为高效切割的RRR|SAG后，完全丧失病毒拯救能力，证明延迟切割对维持NS4A-2K-NS4B前体功能至关重要——该前体已被证明与NS1/NS3互作以启动复制。

这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究首次建立ER微环境与蛋白酶活性的关联，揭示病毒通过精确调控切割动力学协调多蛋白加工进程。不仅为理解黄病毒生命周期提供新视角，更指出靶向NS4A|2K切割时序可能成为抗病毒新策略。针对ER片层特异性切割机制的发现，将推动下一代膜定位抑制剂的开发，突破当前仅靶向催化中心的研发瓶颈。