酶与辅因子工程协同提升D-木糖酸脱水酶活性促进D-1,2,4-丁三醇高效生物合成

推荐：本研究针对D-1,2,4-丁三醇(BTO)生物合成中D-木糖酸脱水酶(YjhG)活性不足导致的底物积累问题，通过随机诱变和定点饱和突变获得催化效率提升1.82倍的YjhGT325F突变体，并优化[Fe-S]簇合成系统(SUF)，使工程菌BT-YjhGT325F-SUF的BTO产量达10.36 g/L(摩尔产率73.6%)，为军事/医药用高值化学品绿色制造提供新策略。

　　

在军事装备推进剂和抗肿瘤药物开发领域，D-1,2,4-丁三醇(BTO)作为关键前体具有不可替代的价值。传统化学合成法依赖高温高压下的苹果酸钠还原，不仅能耗高且产生环境污染物。自2003年实现微生物合成BTO以来，利用木质纤维素衍生的D-木糖生物合成已成为绿色制造的研究热点。然而，该途径中D-木糖酸脱水酶的催化效率低下导致中间产物大量积累，成为制约产业化的关键瓶颈。

针对这一挑战，国内研究团队创新性地提出"酶-辅因子双轨工程"策略。通过建立基于高碘酸氧化的高通量筛选方法，研究人员从2000余个突变体中鉴定出关键位点T325F突变使酶活提升1.82倍。进一步研究发现，该铁硫蛋白的活性受[Fe-S]簇供应限制，通过系统比较SUF/ISC/CSD三种铁硫组装体系，证实SUF系统过表达可协同提升突变体催化效率。最终构建的BT-YjhG^T325F-SUF工程菌在48小时内实现10.36 g/L BTO产量，摩尔转化率达73.6%，较原始菌株提升1.88倍。

研究采用三大关键技术：1) 建立基于D-木糖酸消耗量的高通量比色筛选法；2) 结合Mn²⁺介导的易错PCR与定点饱和突变进行酶定向进化；3) 通过SUF系统(sufABCDSE)过表达优化[Fe-S]簇微环境。

关键结果包括：

3.1 建立的高通量检测法通过HIO₄氧化-Nash试剂显色，实现D-木糖酸的快速定量(R²=0.999)

3.2 从随机突变库筛选的T325F突变体使D-木糖酸消耗量提升1.82倍

3.4 工程菌BT-YjhG^T325F的BTO产量达7.28 g/L，较野生型提高34%

3.5 SUF系统过表达使[Fe-S]依赖的酶活性再提升2.34倍，最终菌株BTO产量突破10 g/L

该研究首次揭示[Fe-S]簇供应与D-木糖酸脱水酶活性的调控关系，为铁硫蛋白的理性改造提供新思路。获得的YjhG^T325F突变体不仅适用于BTO生产，在乙二醇、乙醇酸等C4化学品的生物合成中同样具有应用潜力。研究建立的"酶活性-辅因子供应"协同优化策略，为复杂辅酶依赖型酶的工业化应用提供了普适性方法学指导。论文发表于《Systematic and Applied Microbiology》，相关技术已申请专利保护。