Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂EsKPI-1通过Toll通路调控中华绒螯蟹免疫启动中抗菌肽表达的机制研究

为解决水产养殖中病原菌耐药性问题，大连海洋大学团队揭示了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)免疫启动新机制。研究发现Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂EsKPI-1能显著抑制嗜水气单胞菌(A. hydrophila)生长及其分泌的胞外蛋白酶，并通过激活Toll通路(EsTLR-1/EsMyd88/EsPelle)上调抗菌肽(EsALFs/EsCrustin)表达，为无脊椎动物免疫记忆研究提供重要理论依据。

　　

在水产养殖业面临病原菌肆虐的背景下，中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)作为我国重要经济蟹种，长期遭受嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等病原体威胁。传统抗生素滥用导致耐药菌株频发，而无脊椎动物缺乏适应性免疫系统，其特有的"免疫启动"现象成为突破养殖病害防治瓶颈的新希望。这种类似免疫记忆的机制能使生物体在二次感染时产生更强防御，但其中关键分子调控网络始终是未解之谜。

大连海洋大学的研究团队通过建立嗜水气单胞菌体内免疫启动模型，发现二次刺激后蟹血淋巴中细菌载量显著降低，抗菌活性明显增强。进一步研究锁定了一个关键调控因子——Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂EsKPI-1。该蛋白不仅能直接结合革兰氏阴性菌(A. hydrophila/E. coli)和革兰氏阳性菌(S. aureus)，还可有效抑制病原菌分泌的胞外蛋白酶。通过dsRNA干扰技术敲低EsKPI-1后，蟹类对抗二次感染的能力急剧下降，同时Toll通路关键基因(EsTLR-1、EsMyd88、EsPelle)和抗菌肽(EsALFs、EsCrustin)表达均受抑制，证实了EsKPI-1在免疫启动中的核心地位。论文发表在《Fish & Shellfish Immunology》期刊。

研究主要采用四种关键技术：1) 嗜水气单胞菌二次刺激的体内免疫启动模型；2) 重组蛋白(rEsKPI-1)体外抗菌与蛋白酶抑制实验；3) dsRNA基因沉默技术；4) Toll通路相关分子(EsMyd88、P-EsDorsal)的蛋白含量检测。实验样本来自江苏连云港养殖场的健康中华绒螯蟹。

【主要研究结果】

1. 二次免疫刺激后的抗菌效应
   二次感染组(AH+AH)血淋巴中嗜水气单胞菌载量较初次感染组(Ns+AH)降低83%，抗菌活性显著增强，表明成功建立免疫启动模型。

2. EsKPI-1的免疫功能验证
   rEsKPI-1对多种病原菌具有广谱结合能力，最低抑菌浓度(MIC)对嗜水气单胞菌达12.5μg/mL。更重要的是，其能中和病原菌分泌的金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，破坏细菌毒力因子。

3. 基因沉默导致的免疫缺陷
   EsKPI-1敲除后，二次感染组细菌清除率下降67%，同时血细胞中EsALFs和EsCrustin的mRNA水平分别降低5.2倍和3.8倍，证实该分子是抗菌肽表达的必要调控因子。

4. Toll通路激活机制
   干扰EsKPI-1导致Toll受体EsTLR-1及其下游信号分子EsMyd88、EsPelle表达量显著下调，核转录因子P-EsDorsal(磷酸化状态)含量减少，揭示其通过经典Toll/MyD88/Dorsal通路调控抗菌肽合成。

【结论与意义】
该研究首次阐明EsKPI-1通过双重机制参与甲壳类免疫启动：直接中和病原菌蛋白酶保护宿主组织，同时激活Toll通路诱导长效抗菌肽表达。这一发现不仅为理解无脊椎动物免疫记忆提供分子基础，更为开发新型水产免疫增强剂开辟道路——通过靶向调控KPI分子，有望替代抗生素实现生态养殖。研究还提示，保守的Toll通路可能在各类无脊椎动物免疫启动中发挥普适性调控作用，为比较免疫学研究提供重要范式。