日本鳗鲡肾脏与脾脏连续细胞系的建立及其抗病毒免疫应答功能研究

为解决鳗鲡病毒致病机制及宿主免疫应答研究缺乏稳定细胞模型的问题，研究人员通过组织块培养法成功建立日本鳗鲡（Anguilla japonica）肾脏（AJK）和脾脏（AJSP）连续细胞系。经核型分析和rRNA测序验证细胞来源后，证实两种细胞系均支持AngHV-1病毒高效复制，并通过GFP-LC3质粒转染（最高效率21.43%）和干扰素调控因子（IRF）共转染实验证明其适用于基因功能研究。该成果为鳗鲡抗病毒免疫机制研究提供了重要工具。

　　

鳗鲡养殖业在东亚地区具有重要经济价值，但高密度养殖模式导致病毒性疾病频发，如鳗鲡疱疹病毒1型（AngHV-1）引发的"黏液脱落与出血性败血症"可造成大规模死亡。目前研究面临关键瓶颈——缺乏能够模拟宿主免疫应答的稳定细胞模型。传统鱼类细胞系如虹鳟脾细胞或鲤鱼上皮细胞（EPC）虽可用于部分病毒研究，但无法准确反映鳗鲡特有的免疫机制。此前仅有欧洲鳗鲡肝脏细胞系（EL）和日本鳗鲡卵巢细胞系（EO-2）被报道，其应用范围有限。

福建农林大学海洋学院的研究人员通过组织块培养法，从日本鳗鲡肾脏和脾脏成功建立AJK与AJSP两株连续细胞系。研究显示，两种细胞在DMEM/F-12培养基（含15-20%胎牛血清）中可稳定传代超100代，核型分析证实其具有典型的38条染色体结构（10中着丝粒+10亚中着丝粒+18近端着丝粒）。为验证细胞功能，研究团队采用GFP-LC3质粒转染实验，流式细胞术检测显示AJK细胞转染效率达21.43±0.33%，显著高于AJSP细胞（9.30±0.21%）。在免疫应答研究中，将干扰素调控因子AjIRF1与干扰素启动子（AjIFNa/AjIFNc1）共转染后，两种细胞均表现出显著增强的启动子活性。更重要的是，AngHV-1感染实验证实AJK和AJSP细胞支持病毒高效复制，并触发典型免疫反应。该成果发表于《Fish》期刊。

关键技术包括：1）组织块原代培养法建立细胞系；2）核型分析与rRNA基因测序进行细胞鉴定；3）GFP-LC3报告系统评估转染效率；4）双荧光素酶报告系统检测干扰素启动子活性；5）病毒滴度测定与免疫应答分析。

【主要研究结果】

1. 细胞系建立与表征
   AJK和AJSP细胞在第7天形成单层，呈现梭形纤维母细胞形态。P50代细胞在6天内增殖至6.8×10⁶（AJK）和6.5×10⁶（AJSP），群体倍增时间分别为46.2小时和48.6小时。

2. 基因功能研究平台构建
   使用Lipofectamine 3000转染试剂时获得最高转染效率。AjIRF1过表达使AjIFNa启动子活性提升4.8倍（AJK）和3.2倍（AJSP），证实细胞适用于先天免疫信号通路研究。

3. 病毒易感性分析
   AngHV-1感染后48小时，AJK细胞病毒载量达10^5.8 TCID₅₀/mL，AJSP细胞为10^5.2 TCID₅₀/mL。qPCR检测显示病毒囊膜蛋白基因ORF25表达量随时间显著上升。

4. 免疫应答特征
   病毒感染后，AJK细胞中Mx（黏液病毒抵抗蛋白）基因表达上调12.7倍，AJSP细胞TNF-α（肿瘤坏死因子）升高9.3倍，提示两类细胞可能通过不同通路参与抗病毒反应。

该研究首次建立了具有完整免疫应答功能的鳗鲡肾脏/脾脏细胞模型，解决了该领域长期依赖异源细胞系的困境。AJK和AJSP细胞不仅能用于AngHV-1感染机制研究，其高效的基因操作特性更为解析IRF-IFN信号通路提供了理想平台。未来可通过这些细胞系筛选抗病毒药物或开发鳗鲡特异性疫苗，对保障水产养殖业可持续发展具有重要实践价值。 Zhou Xiaoling等作者特别指出，这两种细胞系对其它鳗鲡病毒（如JEECV、EP1）的易感性仍有待验证，这将是后续研究的重点方向。