自组装纳米载体介导的dsRNA广谱杀菌剂：靶向Rhizoctonia solani糖基水解酶家族1（RsGH1）的新型绿色防控策略

为解决Rhizoctonia solani引起的作物病害防控难题，研究人员开发了一种基于RNA干扰（RNAi）和纳米技术的绿色杀菌剂。通过筛选关键毒力因子糖基水解酶家族1（RsGH1）作为靶标，构建了ε-聚赖氨酸（ε-PL）与羧甲基壳聚糖（CMCS）自组装纳米载体（ε-PL@CMCS），显著提升了双链RNA（dsRNA）的稳定性、叶片附着性和RNAi效率。该研究为广谱防控R. solani提供了环境友好型新策略，相关成果发表于《Materials Today Bio》。

　　

在农业生产中，由丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的作物病害如烟草靶斑病和水稻纹枯病，每年造成全球范围内巨大的产量损失。传统化学杀菌剂不仅面临病原菌抗药性问题，还可能对环境产生负面影响。如何开发高效、环保的新型防控手段，成为农业可持续发展的重要挑战。

针对这一难题，沈阳农业大学植物保护学院的研究人员创新性地将RNA干扰（RNAi）技术与纳米载体相结合，开发出一种自组装纳米颗粒负载的双链RNA（dsRNA）杀菌剂。他们首先通过宿主诱导基因沉默（HIGS）技术筛选出R. solani AG3 TB的关键毒力因子——糖基水解酶家族1（RsGH1），该酶通过降解植物细胞壁中的纤维素促进病原菌侵染。研究人员发现，沉默RsGH1可显著降低病原菌的致病力，但裸露的dsRNA易受环境核酶降解且叶片附着性差。

为解决这些问题，研究团队设计了一种由ε-聚赖氨酸（ε-PL）和羧甲基壳聚糖（CMCS）通过静电作用自组装形成的纳米载体（ε-PL@CMCS）。当两者质量比为1:1时，形成的纳米颗粒粒径均匀（216.7 nm）、稳定性好（可保持13天不聚集），并能高效负载带负电的dsRNA。等温滴定量热（ITC）分析揭示，ε-PL与CMCS的结合过程是自发进行的（ΔG为负值），主要驱动力包括静电相互作用、氢键和范德华力。

在技术方法上，研究通过以下关键实验验证效果：1）利用农杆菌介导的瞬时表达和转基因技术验证RsGH1的致病功能；2）采用HT115(DE3)大肠杆菌系统规模化生产dsRNA；3）通过透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征纳米载体特性；4）使用接触角测量和荧光标记评估叶片吸附性；5）通过qPCR检测病原菌生物量和靶基因沉默效率。

研究结果部分显示：
3.1. dsRNA靶向RsGH1抑制R. solani AG3 TB侵染
HIGS筛选发现沉默RsGH1使烟草病斑直径减少64.8%，病原菌生物量降低76.8%。转基因烟草实验证实，持续表达RsGH1-dsRNA可提高抗病性。

3.2. 纳米载体的合成与表征
ε-PL@CMCS在1:1质量比下形成粒径均一的球形纳米颗粒（PDI=0.2），zeta电位为+28 mV，能有效保护dsRNA免受RNase A降解（30分钟后保留56.2%完整性）。

3.3. ε-PL@CMCS增强dsRNA稳定性
复合物使dsRNA在烟草植株内的滞留时间从13天延长至21天，显著高于裸露dsRNA。

3.4. 提升附着性能和吸收效率
纳米载体使dsRNA在烟草叶片上的接触角从105°降至85°，保留量增加37%（8.9 vs 6.5 mg/cm²）。Cy3标记实验显示纳米载体组荧光强度提高3倍。

3.5. 高效防控R. solani
dsRsGH1@ε-PL@CMCS对烟草靶斑病的防效达63.4%，且对水稻纹枯病（AG1-IA）也表现出广谱抑制效果，使病原菌生物量显著降低。

这项研究的突破性在于：首次将ε-PL与CMCS的协同效应应用于植物病害防控，创建的纳米载体系统兼具dsRNA保护、叶片亲和性和跨AG型广谱抑制三大优势。相比传统化学农药，这种基于生物大分子的杀菌剂具有环境友好、靶向精准的特点，为RNAi技术的田间应用提供了可推广的解决方案。研究还发现源自AG3 TB的dsRsGH1对AG1-IA具有交叉保护作用（序列同源性83.6%），这为开发广谱性生物农药提供了新思路。未来通过优化纳米载体配方和规模化生产工艺，该技术有望成为综合防治R. solani病害的重要工具。