基于立体选择性共价探针的骨肉瘤治疗新靶点Nogo-B的发现及其PI3K/AKT/NF-κB通路机制研究

本研究通过构建立体多样性共价小分子库，结合活性蛋白分析(ABPP)技术，首次鉴定神经突生长抑制因子B(Nogo-B)为骨肉瘤(OS)治疗新靶点。研究发现立体选择性化合物(S,R)-4v通过共价结合Nogo-B的Cys47位点，抑制PI3K/AKT/NF-κB通路，显著抑制143B细胞增殖(IC50=0.28μM)和体内肿瘤生长。该研究为骨肉瘤靶向治疗提供了新策略，发表于《Cell Death and Disease》。

　　

骨肉瘤作为儿童青少年最常见的恶性骨肿瘤，近50年来靶向治疗进展缓慢，转移患者五年生存率仍低于20%。传统基因组学方法因肿瘤突变负荷高、染色体碎片化严重难以识别有效靶点，而平面结构的共价药物对骨肉瘤疗效有限。针对这一临床困境，华东师范大学的研究团队创新性地通过多组分一锅法构建了含丙烯酰胺弹头的立体多样性共价分子库（37个化合物），结合表型筛选发现(S,R)-4v对143B细胞具有纳摩尔级抑制活性（IC₅₀=0.28μM）。该研究发表于《Cell Death and Disease》，为骨肉瘤治疗提供了突破性靶点。

研究采用活性蛋白分析(ABPP)技术结合立体异构体对照策略（以活性较弱的(R,S)-4w为对照），通过链霉亲和素富集和LC-MS/MS鉴定，首次将50kDa靶蛋白确定为Nogo-B。关键实验技术包括：1）基于细胞热转移实验(CETSA)验证靶点结合；2）分子对接预测Cys47共价结合位点；3）shRNA敲低和过表达验证功能依赖性；4）异种移植模型评估体内疗效。

【研究结果】

1. 立体选择性抑制剂的发现：
   通过表型筛选发现(S,R)-4v对143B细胞具有显著选择性，其抑制活性较其他异构体高30倍（IC₅₀：(S,R)-4v 0.28μM vs (R,S)-4v 8.32μM）。伤口愈合和集落形成实验证实该化合物可抑制细胞迁移和增殖。

2. 靶点鉴定与验证：
   

   

   
   凝胶电泳和链霉亲和素印迹显示(S,R)-4w特异性标记50kDa蛋白，竞争实验证实(S,R)-4v可剂量依赖性阻断标记。质谱分析鉴定该靶点为Nogo-B，其富集比达19倍。

3. 机制解析：
   (S,R)-4v通过共价结合Nogo-B的Cys47（分子对接证实）下调其蛋白水平（非mRNA水平），抑制PI3K/AKT依赖的NF-κB通路，导致凋亡相关蛋白Bcl-2减少。Nogo-B敲除可减弱(S,R)-4v的抗肿瘤效果（IC₅₀从0.28μM升至1.11μM）。

4. 体内疗效评估：
   30 mg/kg剂量下，(S,R)-4v使异种移植瘤体积减少70%（p<0.001），且未引起心、肝、肾毒性（HE染色证实）。Nogo-B敲除小鼠模型进一步验证了靶点特异性。

【结论】
该研究创新性地将立体化学多样性共价探针与ABPP技术结合，克服了骨肉瘤靶点识别难题，首次揭示Nogo-B通过PI3K/AKT/NF-κB通路调控骨肉瘤进展。化合物(S,R)-4v作为先导药物，为开发针对罕见癌症的靶向疗法提供了新范式。研究策略可推广至其他难治性肿瘤的靶点发现，具有重要转化价值。