乳酸杆菌Helveticus细胞膜蛋白酶催化三联体Ser-His-Asp动态作用机制研究及其在乳品工业中的应用价值

本研究针对乳酸菌细胞膜蛋白酶(CEPs)催化机制不明确的问题，通过分子对接和动力学模拟技术，首次揭示了L. helveticus CNRZ32菌株PR结构域中催化三联体Asp-His-Ser(D-H-S)在酪蛋白水解过程中的分子机制，证实Ser608和His270是催化核心位点，为CEPs基因改造和乳制品工业应用提供了理论依据。

　　

在乳制品发酵过程中，乳酸菌(Lactic Acid Bacteria, LAB)通过其复杂的蛋白水解系统将牛奶蛋白转化为具有多种生理活性的小肽，这一过程的核心在于细胞膜蛋白酶(Cell-envelope proteinases, CEPs)的催化作用。作为subtilisin-like丝氨酸蛋白酶家族成员，CEPs不仅影响细菌生长，更直接决定了发酵乳制品的质地、风味特征，以及具有降压、抗菌、抗氧化等功能的生物活性肽生成。然而，尽管CEPs在乳品工业中具有重要应用价值，其精确的催化机制特别是PR结构域中经典催化三联体Asp-His-Ser(D-H-S)的动态作用过程仍不明确，这严重制约了通过基因工程技术定向改造CEPs的进程。

针对这一科学问题，来自陕西"科学家+工程师"团队的研究人员选择具有重要工业应用价值的L. helveticus CNRZ32菌株作为研究对象，借助生物信息学分析和分子模拟技术，首次系统解析了其CEPs中PR结构域催化三联体的动态作用机制。这项发表在《Enzyme and Microbial Technology》的研究，为CEPs的理性设计和乳制品工业应用提供了重要理论支撑。

研究人员主要采用三种关键技术方法：通过NCBI GenBank和Uniprot数据库获取PR结构域氨基酸序列信息；运用Modeller 9.18软件进行同源建模构建三维结构；结合分子对接和分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟分析催化三联体与底物的相互作用。特别选择了L. helveticus CNRZ32特异性识别的酪蛋白片段IKHQ作为研究对象。

在"PR结构域的结构特征"部分，研究发现L. helveticus CNRZ32的CEP被鉴定为prtH基因编码，包含S、PP、PR(含PA插入域)、A、B、H、W和SlpA七个预测结构域。值得注意的是，PR结构域被蛋白酶相关(Protease Associated, PA)域分割为PR1和PR2两部分，其中包含关键的催化三联体残基。

通过"分子建模与动力学分析"，研究证实催化三联体在PR结构域激活过程中起核心作用。分子对接结果显示，Ser608和His270构成催化过程的中心位点，这与经典丝氨酸蛋白酶中Asp102-His57-Ser195的"电荷接力"机制相呼应。动力学轨迹分析揭示了底物结合时催化残基的构象变化规律。

在"催化机制解析"方面，研究详细阐述了D-H-S三联体的分子作用机理：Ser608的羟基氧对底物羰基碳进行亲核攻击，其羟基质子转移至His270的咪唑环，最终传递给离开基团；而Asp残基则通过精确定位His270来调控Ser608的极性。这一过程与三个Ca²⁺结合位点共同维持了催化微环境稳定。

研究结论部分强调，这项工作首次通过计算机模拟阐明了L. helveticus CEPs中PR结构域催化三联体的动态作用机制，特别是明确了Ser608和His270在催化过程中的核心地位。这一发现不仅深化了对CEPs催化机理的认识，更重要的是为后续通过基因编辑技术定向改造CEPs、优化其催化特性提供了明确靶点，对开发功能性发酵乳制品具有重要指导价值。

正如作者Guanli Du和He Chen团队在讨论中指出的，这项研究建立的PR结构域模型和催化机制解析方法，可推广应用于其他LAB菌株CEPs的研究。随着生物信息学技术的不断发展，这种"in silico"研究策略将为食品酶学的机制研究开辟新途径，加速从基础研究到工业应用的转化进程。