基于MinION测序的FLT3-ITD多克隆分析：定制化聚类策略增强AML亚克隆检测

这篇研究通过牛津纳米孔（MinION）长读长测序技术，开发了一种针对FLT3-ITD（内部串联重复）的定制化生物信息学流程，克服了传统毛细管电泳（CE）和通用结构变异检测工具（如Sniffles）在AML（急性髓系白血病）亚克隆检测中的局限性。该方法通过90%相似性阈值聚类，成功识别低至15bp的短插入变异及低频亚克隆（VAF~5%），揭示了AML中复杂的多克隆架构，为精准医疗提供了新工具。

　　

背景

急性髓系白血病（AML）是一种高度异质性的血液恶性肿瘤，其中FLT3基因的内部串联重复（FLT3-ITD）突变是关键的驱动因素，与不良预后和治疗耐药密切相关。传统检测方法如毛细管电泳（CE）仅能提供片段大小信息，而短读长测序技术（如Illumina）在重复区域的覆盖度和低频变异检测上存在局限。第三代测序（TGS）如牛津纳米孔MinION凭借长读长优势，可跨越重复区域，但需解决高错误率（~10%）和亚克隆分辨率的挑战。

材料与方法

研究团队开发了一套定制化分析流程：

1. 样本处理：从5例AML患者（3例FLT3-ITD阳性）骨髓中提取RNA，通过RT-PCR扩增FLT3的膜旁结构域。
2. 测序：使用MinION进行测序，采用Dorado双链校正提升准确性。
3. 生物信息学分析：通过minimap2比对后，基于90%序列相似性阈值聚类插入序列，利用Biopython生成共识序列，区分真实变异与测序噪声。

结果

• 多克隆架构：样本pos3中鉴定出80bp和30bp两个主要克隆群，以及多个低频亚克隆（<10% VAF），揭示AML的克隆分支演化。
• 技术对比：MinION检测的ITD长度与CE一致，但额外发现CE遗漏的短插入（如15bp）和低频变异（~5% VAF）。Sniffles在30bp以下插入检测中表现不佳。
• 阈值优化：Sankey图显示，90%相似性阈值平衡了噪声过滤与亚克隆分辨，而低于80%会过度合并异质性克隆。

讨论

该研究凸显了长读长测序在解析AML克隆复杂性中的价值：

• 临床意义：低频亚克隆可能预示复发风险，如pos3中30bp克隆的独立断点提示平行演化。
• 局限性：低深度样本（<500×）可能漏检极低频变异，未来需引入分子标签（UMIs）提升灵敏度。
• 技术拓展：该流程可延伸至CEBPA等其他ITD高发基因，推动血液肿瘤的精准分型。

结论

MinION结合定制化聚类策略显著提升了FLT3-ITD检测的敏感性和分辨率，为AML的克隆异质性研究提供了新范式。未来需扩大样本验证其预后关联，并优化计算效率以适应临床诊断需求。