热耐受酵母Ogataea polymorpha高效木糖发酵菌株的正向筛选及其API1/IRA1基因调控机制解析

本研究针对木质纤维素生物质高温同步糖化发酵(SSF)过程中缺乏高效乙醇生产菌株的难题，通过正向筛选策略获得能在45°C下将木糖发酵效率提升50倍的Ogataea polymorpha突变株A107。全基因组测序发现API1(阿拉伯糖-5-磷酸异构酶)和IRA1(Ras-GTP酶激活蛋白)基因突变是关键调控靶点，其中ira1△突变使木糖和L-阿拉伯糖发酵效率分别提高1.3倍和6倍，API1过表达则特异性增强L-阿拉伯糖代谢。该研究为高温生物燃料生产提供了突破性菌种资源，相关成果发表于《Scientific Reports》。

　　

在生物燃料领域，如何高效利用木质纤维素中的五碳糖始终是个"卡脖子"难题。传统酿酒酵母在高温下"罢工"，而天然耐热的Ogataea polymorpha酵母虽能在50°C生长，却对木糖"暴殄天物"——野生型菌株仅产生0.4 g/L乙醇。更棘手的是，木质纤维素酶的最适工作温度恰在50°C左右，这种"温度错配"使得同步糖化发酵(SSF)工艺难以实现。

波兰热舒夫大学医学院生物技术系与乌克兰国家科学院细胞生物学研究所的联合团队另辟蹊径，开发出基于L-阿拉伯糖生长的正向筛选策略。研究人员先给工程菌株BEP/cat8△/DAS1/TAL2做"紫外线美黑"，再让它们在含15% L-阿拉伯糖的培养基上"选秀"，最终获得"三料冠军"A107菌株——不仅木糖发酵创下20.91 g/L的45°C纪录，还能顺带消化L-阿拉伯糖。这项突破性研究近日登上《Scientific Reports》期刊。

关键技术包括：UV诱变结合L-阿拉伯糖正向筛选、2-脱氧葡萄糖(2-DG)和3-溴丙酮酸(BrPA)抗性筛选、全基因组测序鉴定突变位点、API1/IRA1基因敲除与过表达构建、qRT-PCR验证基因表达、HPLC代谢产物分析等。

【Isolation of O. polymorpha strains with improved alcoholic fermentation of xylose and L-arabinose through a new positive selection method】
通过"饥饿游戏"式筛选，突变株A107在木糖培养基中展现出"碾压式"优势：乙醇产量较野生型提升50倍，且不积累木糖醇。有趣的是，这些"大胃王"在L-阿拉伯糖平板上长得快，实际发酵时却"挑食"——仅产0.23 g/L乙醇，暗示五碳糖代谢存在"差别待遇"。

【Identification, construction, and analysis of O. polymorpha yeast transformants with deletion and overexpression of the API1 gene】
基因组测序发现的API1基因堪称"意外收获"——这个细菌中负责KDO合成的酶，在酵母里竟变身"阿拉伯糖开关"。过表达API1使L-阿拉伯糖发酵翻倍，但对其"兄弟"木糖毫无影响，这种特异性调控在酵母中尚属首见。

【Identification, construction, and analysis of O. polymorpha yeast transformants with deletion and overexpression of the IRA1 gene】
IRA1基因的移码突变揭示了"能量阀门"机制：删除这个Ras/cAMP通路"刹车片"后，菌株像装上涡轮增压——木糖消耗速率提升1.5倍，乙醇产量增加60%。但过度激活也有代价：突变株在47°C和pH4下"娇气"十足，说明细胞需要精准调控"能量油门"。

【Functional analysis of genetic changes in the O. polymorpha adaptation to high xylose concentrations and environmental stress conditions】
在20%高糖压力下，ira1△突变株展现出"逆生长"特性，而API1过表达株则成为"耐酸小强"。这种性状分化提示：API1像"特种兵"专攻阿拉伯糖，IRA1则是"全能教官"调控全局应激响应。

这项研究不仅创造了高温木糖发酵的纪录，更揭示了五碳糖代谢的"双轨制"调控：API1是L-阿拉伯糖的"专属钥匙"，而IRA1通过Ras/cAMP通路充当"中央控制器"。A107菌株的工业化应用将显著降低SSF工艺的冷却能耗，其"一菌双吃"特性还为混合糖利用提供新思路。值得注意的是，酵母中API1的功能完全颠覆细菌认知，这种"跨界任职"现象将为进化生物学带来新启示。未来通过平衡IRA1调控强度、优化API1表达时序，有望打造更完美的"生物燃料工厂"。