通过hTERT转染建立永生化牛回肠上皮细胞系及其屏障功能研究

本研究针对畜牧业研究中缺乏牛源肠道上皮细胞模型的问题，通过转染人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)成功建立了永生化牛回肠上皮细胞系(IBEC)。该细胞系保留了原代细胞的形态学和生理学特征，TEER检测证实其屏障功能与IPEC-J2细胞相似，为研究牛肠道屏障功能、病原体感染和炎症反应提供了重要工具。研究成果发表在《Scientific Reports》期刊。

　　

肠道作为机体与外界环境交互的第一道防线，其上皮细胞的屏障功能对动物健康至关重要。在畜牧业生产中，肠道屏障功能障碍常导致饲料转化率下降、肝脏脓肿等疾病，给养殖业带来巨大经济损失。然而，牛源肠道上皮细胞模型的缺乏严重制约了相关研究的开展。原代细胞培养存在成本高、周期短、操作复杂等问题，而现有的商业化细胞系多为人类或小鼠来源，无法准确反映反刍动物的生理特性。

为解决这一技术瓶颈，Kemin Industries, Inc的研究人员开展了一项创新性研究。他们从2日龄混种犊牛回肠组织中分离原代上皮细胞(PBECs)，通过转染人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)成功建立了永生化牛回肠上皮细胞系(IBEC)。该研究成果发表在《Scientific Reports》期刊，为牛肠道生理和病理研究提供了重要工具。

研究人员采用的主要技术方法包括：从犊牛回肠组织分离原代上皮细胞；通过hTERT转染和G418筛选建立永生化细胞系；RT-qPCR鉴定细胞标志物表达；Trans-Epithelial Electrical Resistance(TEER)检测评估屏障功能；比较IBEC与原代细胞及IPEC-J2细胞对脂多糖(LPS)和钙丁酸盐的响应差异。

在"Isolation, culture, and immortalization of PBECs"部分，研究详细描述了从犊牛三种肠段分离原代细胞的过程，通过EpCAM磁珠分选获得纯度>90%的上皮细胞。转染后细胞形态保持稳定，经检测无支原体污染。RT-qPCR结果显示IBEC高表达肠道上皮标志物TMPRSS15、VIL1和上皮标志物KRT18、CDH1，而纤维细胞标志物VIM呈阴性，证实获得了纯净的上皮细胞系。

"PBEC and IBEC identification via RT-qPCR"部分显示，hTERT在IBEC中稳定表达(Ct值24.76-28.13)，而原代细胞中未检测到。所有样本均高表达肠上皮特异性基因，证实细胞类型正确。值得注意的是，VIM基因在原代细胞中有微弱表达(Ct值39.89)，经永生化处理后完全消失，表明IBEC纯度更高。

"Cellular morphology and Trans-Epithelial electrical resistance assays"部分通过TEER检测评估细胞功能。经14天极化培养后，IBEC与原代细胞形态相似，而IPEC-J2细胞在LPS处理后死亡。功能实验显示，100μM钙丁酸盐可显著提升三种细胞的TEER值，而10 ng/mL LPS则降低屏障功能。重要的是，IBEC与原代细胞对处理因素的反应模式高度一致，证明永生化过程未改变细胞基本生理特性。

该研究成功建立了首个永生化牛回肠上皮细胞系，解决了畜牧业研究中长期缺乏合适体外模型的难题。与现有IPEC-J2细胞相比，IBEC更适用于反刍动物研究；与原代细胞相比，IBEC具有无限增殖、操作简便、成本低廉等优势。TEER实验证实该细胞系能准确模拟肠道屏障功能，可用于研究饲料添加剂、病原体感染、炎症反应等多种科学问题。特别值得注意的是，IBEC对LPS和钙丁酸盐的反应模式与猪源细胞存在差异，凸显了物种特异性研究的重要性。

这项研究为牛肠道生理和病理机制研究提供了重要工具，未来可在微生物-宿主互作、免疫应答、代谢调控等领域发挥重要作用。研究人员也指出，后续应开展更多功能验证实验，并探索该细胞系在不同研究场景中的应用潜力。该细胞系的建立将显著推动反刍动物肠道健康研究的进展，为开发新型饲料添加剂和疾病防控策略奠定基础。