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本文聚焦霍乱弧菌 II 型分泌系统（T2SS），揭示 EpsC 的 C 端 PDZ 结构域是丝氨酸蛋白酶 VesB 分泌的关键。研究证实 VesB 的 Ig 样折叠含 PDZ 依赖的分泌信号，可移植至 β- 内酰胺酶使其分泌。这为 T2SS 底物选择机制提供新见解，凸显 EpsC 同源物 C 端域对特定底物分泌的必要性。
摘要
革兰氏阴性致病菌霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的 II 型分泌系统（Type II Secretion System, T2SS）是重要毒力因子，其可分泌霍乱毒素等物质，引发感染相关的严重水样腹泻。霍乱弧菌的 eps 基因编码 T2SS 组件，这些基因缺失会阻碍近 24 种蛋白底物分泌，导致突变菌生长不良等问题。本研究探究了 T2SS 组件 EpsC 的 C 端 PDZ 结构域的作用，发现 pdz 基因缺失不影响霍乱弧菌生长，且质谱分析显示丝氨酸蛋白酶 VesB 是唯一完全依赖 PDZ 结构域分泌的已知 T2SS 底物。免疫和酶学实验证实，VesB 的免疫球蛋白（Ig）样折叠含 PDZ 依赖的分泌信息，将该信息移植到 β- 内酰胺酶（β-lactamase）上，可使这种原本位于周质的蛋白以 PDZ 依赖方式分泌。本研究为 T2SS 底物选择机制提供了新证据，证实 EpsC 及其同源物的 C 端结构域仅调控特定物种中部分 T2SS 底物的分泌。
重要性
II 型分泌系统（T2SS）在革兰氏阴性致病菌中普遍存在，可促进多种毒素和酶的分泌，但其底物选择和分泌机制尚不明确。本研究证实，T2SS “钳位” 蛋白 EpsC 的 C 端 PDZ 结构域仅为霍乱弧菌中 VesB 的分泌所必需，且 VesB 的 Ig 折叠含 PDZ 依赖的分泌信息，该信息可功能性移植到非分泌型周质蛋白上。
引言
II 型分泌系统（T2SS）是一种多蛋白纳米机器，可从多种革兰氏阴性细菌中分泌水解酶和毒力因子，这些细菌栖息于不同环境生态位。植物和人类致病菌利用 T2SS 逃避宿主免疫、形成生物膜、与其他物种竞争及从宿主获取资源。霍乱弧菌在水生环境中利用 T2SS 分泌几丁质结合蛋白 GbpA 和几丁质酶获取营养；进入人体肠道后，T2SS 分泌霍乱毒素（CT）、蛋白酶等，助力其致病。
T2SS 分泌过程中，前体底物先通过 Sec 或 Tat 转运蛋白进入周质，去除信号肽后折叠为天然构象，再被 T2SS 识别并分泌到胞外。霍乱弧菌 T2SS 的 15 个组件均称为 “胞外蛋白分泌 X”（Eps_），共同形成由 ATP 酶驱动、跨内膜的内菌毛复合体，并与外膜的 secretin 孔道（EpsD）相连。
EpsC 是 T2SS 的核心组件，被称为 “钳位” 蛋白，因其可将内膜和外膜结构连接起来。EpsC 有三个结构域：N 端跨膜（TM）螺旋，与内膜内菌毛平台结合；周质同源区（HR 结构域），结合 T2SS secretin 孔道（EpsD）的 N0 结构域；C 端 PDZ 结构域，功能未知。PDZ 结构域是普遍存在的蛋白 - 蛋白相互作用结构域，在真核生物膜相关复合体中通过结合蛋白 C 端发挥作用；在细菌中，PDZ 结构域常存在于蛋白酶中，如大肠杆菌的 DegS。虽推测 T2SS 的 PDZ 结构域可能参与底物选择，但具体作用不明。
转座子突变筛选显示，霍乱弧菌 T2SS 的 eps 基因至关重要，缺失整个 eps 操纵子或单个基因（如 epsC、epsD 等）会导致底物分泌受阻、生长缺陷和细胞完整性改变，还会筛选出抑制致死表型的二次突变。有趣的是，epsC 被鉴定为 “结构域必需” 基因，转座子插入仅出现在编码 C 端 PDZ 结构域的区域（约 300 个核苷酸），而编码 TM 或 HR 结构域的区域未发现插入。EpsC 的 PDZ 结构域在 IV 型菌毛的同源物 PilP 中缺失，且不同物种 T2SS 的该区域差异显著，如军团菌的 LspC 无 PDZ 结构域，铜绿假单胞菌的 XcpP 此位置为卷曲螺旋结构域。植物致病菌 Dickeya dadantii 的 EpsC 同源物 OutC 的 PDZ 结构域仅调控部分 T2SS 底物分泌，但其他物种中是否如此尚不明确。
本研究证实，缺失 EpsC 的部分必需区域会导致霍乱弧菌生长问题，但缺失 C 端 PDZ 结构域无此影响。通过质谱、免疫和酶学实验发现，PDZ 结构域缺失显著减少丝氨酸蛋白酶 VesB 的分泌，对其同源物 VesA 和 VesC 的分泌影响较小。此外，VesB 的 Ig 折叠结构域可移植到周质蛋白 β- 内酰胺酶上，使其以 PDZ 依赖方式分泌到胞外。
结果
EpsC 的 C 端 PDZ 结构域缺失阻碍丝氨酸蛋白酶分泌但不影响生长
此前转座子突变筛选表明，破坏 EpsC 的 PDZ 结构域不影响霍乱弧菌生长，而破坏 T2SS 其他组件或 EpsC 其他区域则相反。为探究原因，研究人员删除基因组中 pdz 区域（编码 Q203-F305 氨基酸），或用卡那霉素盒替换整个 epsC 基因（epsC::kan），并分析不同 epsC 质粒构建体对生长的互补作用。与转座子筛选结果一致，3083?epsC 在 LB 培养基中 37°C 下生长缺陷，而 3083epsC?PDZ 生长与野生型（WT）霍乱弧菌 3083 相当。在 epsC::kan 突变体中，异位表达含缺陷 HR 编码区的 epsC 无法恢复 WT 生长，而表达全长 epsC 或 epsC?pdz 可互补生长缺陷，表明 PDZ 结构域缺失对霍乱弧菌无显著影响。
实验室此前研究表明，以荧光甲基香豆素缀合肽（Boc-Gln-Ala-Arg-AMC）为底物检测培养上清中的丝氨酸蛋白酶活性，可监测霍乱弧菌的蛋白分泌，因 T2SS 是三种丝氨酸蛋白酶胞外转运所必需。本研究用该实验检测 epsC 修饰对分泌的影响，证实 epsC::kan 突变体生长差且丝氨酸蛋白酶分泌功能缺失，epsC?hr 在 epsC::kan 突变体中的异位表达也如此。有趣的是，epsC?pdz 突变体生长与 WT 相当，但无法分泌活性丝氨酸蛋白酶。
为明确 PDZ 结构域的功能边界，研究分析了两种 EpsC PDZ 结构域晶体结构：“长” PDZ（G204-F305，PDB 2I4S）和截短的 “短” PDZ（Q219-F305，PDB: 2I6V，不含 α1 螺旋）。结果显示，PDZ 的 α1 螺旋缺失不影响丝氨酸蛋白酶分泌，而去除 α2 螺旋或 C 端截短超过最后两个氨基酸（Q304 和 F305）则会干扰分泌。此外，将 EpsC 的 PDZ 结构域替换为嗜水气单胞菌 ExeC、肺炎克雷伯菌 PulC、大肠杆菌 GspCEc、鲍曼不动杆菌 GspCAb的 PDZ 结构域，或铜绿假单胞菌 XcpP 的卷曲螺旋结构域，构建 EpsC 嵌合体。结果仅嗜水气单胞菌和肺炎克雷伯菌的 PDZ 嵌合体可互补 epsC::kan 突变体，其他三种嵌合体无法恢复丝氨酸蛋白酶分泌。所有 PDZ 修饰（嵌合体和截短）均能互补 epsC::kan 突变体的生长表型，表明这些修饰不影响 EpsC 的 TM 或 HR 结构域功能。这些数据明确了霍乱弧菌中丝氨酸蛋白酶分泌所需的 PDZ 结构域范围，提示 PDZ 结构域的物种特异性相互作用对有效分泌至关重要，且嗜水气单胞菌和肺炎克雷伯菌的 PDZ 结构域可能参与分泌与霍乱弧菌丝氨酸蛋白酶性质相似的蛋白。
质谱分析显示 VesB 是唯一依赖 PDZ 结构域分泌的 T2SS 底物
为验证丝氨酸蛋白酶对 PDZ 结构域的依赖，并评估 epsC?PDZ 菌株分泌谱（分泌组）的差异，研究对 WT 和 epsC?PDZ 突变体的霍乱弧菌培养上清进行蛋白质组学分析。通过对过夜培养上清蛋白沉淀进行液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）和定量谱计数，发现 epsC?PDZ 突变体上清中 5 种蛋白丰度显著降低（P < 0.01）。周质群体感应蛋白 LuxP、外膜 LPS 组装蛋白 LptE 及两种假设的周质 ABC 型转运蛋白组件 VC_A0212 和 VC_2622 虽丰度降低，但接近 2 倍变化阈值。唯一显著减少的已知 T2SS 底物是丝氨酸蛋白酶 VesB。已知 T2SS 分泌的三种同源 Ves 蛋白酶（VesA、VesB、VesC）中，VesB 贡献约 80% 的上清丝氨酸蛋白酶活性，这与 epsC?pdz 背景下胞外丝氨酸蛋白酶活性显著降低的结果一致。
LB 培养基中霍乱毒素（CT）表达量低，质谱仅检测到其 B 亚基（CtxB）。为评估 PDZ 结构域缺失对 CT 分泌的影响，研究人员在 AKI 培养基中培养 WT 和 epsC?pdz 菌株以诱导 CT 表达，用 PRMM 沉淀上清蛋白，通过 Western blot 检测抗 CT 抗体（识别 A 和 B 亚基）。结果显示，epsC?pdz 菌株仍能分泌 CT，但 A 亚基（CtxA）未被切割。CtxA 切割是生成活性 CtxA-1 和引发分泌性腹泻的前提，而 T2SS 底物 HapA、VesA、VesB 均能切割 CtxA。霍乱弧菌 N16961 株的 hapR 基因移码突变导致 HapA 表达显著降低，缺失 hapA 的 N16961 突变体与 WT 的 CtxA 切割无差异；而缺失 VesA 或 VesB 会减少 CtxA 切割。epsC?pdz 突变体中 CtxA 加工缺失与 VesB 分泌减少一致。
VesB 通过 T2SS 分泌依赖 PDZ 结构域的验证
VesB 是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，含免疫球蛋白（Ig）样结构域和 C 端跨膜螺旋（GlyGly-CTERM），后者经 C 端加工后有助于其分泌后与细胞表面结合。为验证 LC-MS/MS 结果，研究人员在?vesABC 或?vesABC epsC?PDZ 突变体中异位表达 vesB，发现 PDZ 缺失完全消除上清中的蛋白酶活性。通过 Western blot（使用多克隆 VesB 抗血清）分析 LB 培养样本，进一步证实该结果。质粒表达不同 VesB 构建体表明，VesB 的 PDZ 依赖分泌不依赖其蛋白水解活性（VesB-S221A 无催化活性），且缺失 GlyGly 基序 C 端残基的 VesB（VesB?20）仍能以 PDZ 依赖方式分泌。VesB 是分泌后激活的酶原，在 epsC?PDZ 背景下表达的 VesB 因含前肽，在 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶中的位置略高于正常位置。
实验室此前研究表明，WT VesB 主要定位于细胞表面，经 T2SS 转运后少量释放到胞外。为探究 EpsC 的 PDZ 结构域缺失对 VesB 表面定位的影响，研究人员用 VesB 抗血清和 AlexaFluor 488 标记的二抗检测完整细胞表面的 VesB。缺失染色体 vesB 的 WT 和 epsC?PDZ 霍乱弧菌菌株经 IPTG 诱导表达质粒编码的无催化活性 VesB（VesB-S221A）后，通过免疫荧光显微镜和悬浮细胞总荧光分析发现，epsC?PDZ 突变体细胞表面未检测到 VesB。
用多粘菌素 B 释放周质内容物，经超声破碎和超速离心进行亚细胞分级，结果显示 WT 霍乱弧菌中 VesB 与总膜和上清组分相关，而 VesB?20 完全存在于上清中。内膜 T2SS 组件 EpsL 的 Western blot 作为膜组分对照，pMMB67EH 质粒表达的周质 β- 内酰胺酶活性作为周质组分对照。这些数据与此前研究一致，强调 GlyGly-CTERM 对 VesB 表面定位的必要性，且缺失该基序后 VesB 仍能正常分泌。在 epsC?PDZ 突变体中，VesB 完全与总膜组分结合，VesB?20 定位于周质区。结合免疫荧光显微镜结果，表明 VesB 的外膜转运（表面定位的前提）完全依赖 PDZ 结构域。
VesB 同源物的分泌受 PDZ 结构域缺失的影响较小
研究发现 Dickeya dadantii 的果胶酸裂解酶同源物对 PDZ 结构域的分泌依赖存在差异。霍乱弧菌的 VesB 有两个同源丝氨酸蛋白酶 VesA 和 VesC，质谱数据显示二者分泌不受 PDZ 结构域缺失显著影响。为验证这一结果，研究人员构建了 GlyGly 基序 C 端残基替换为 His6标签的 Ves 蛋白酶，通过 Western blot 分析其分泌。与 VesB 不同，epsC?PDZ 突变体中 VesA 和 VesC 仍主要分泌，仅少量滞留于细胞组分中。
T2SS 突变体中 VesC 的胞内滞留对霍乱弧菌有毒性，部分 T2SS 突变体含 vesC 突变可部分缓解致死表型。通过 RpoE 启动子融合细菌 Lux 报告基因监测胞外应激，发现 epsC?PDZ 突变体中少量 VesC 滞留会轻微增加胞外应激，但应激水平远低于缺失整个 eps 操纵子或 epsD 的突变体。在 epsC?PDZ 突变体中缺失 vesC 可缓解应激，但 T2SS 突变体即使缺失 vesC 仍有生长缺陷，表明 VesC 滞留并非 T2SS 突变体生长缺陷的唯一原因。综上，霍乱弧菌 T2SS 分泌的三种丝氨酸蛋白酶同源物受 PDZ 结构域缺失的影响不同：VesB 分泌完全依赖 PDZ 结构域，而 VesC 和 VesA 在 PDZ 缺失时仍能分泌，效率略有降低。
VesB 的 Ig 折叠含 PDZ 依赖的分泌信号
Pineau 等人研究表明，Dickeya dadantii 的 T2SS 底物 PelI 的纤连蛋白（Fn3）结构域（Ig 超家族成员）与 EpsC 同源物 OutC 的 PDZ 结构域直接相互作用。因 Fn3 结构域是 Ig 超家族的子类，研究人员探究 VesB 的 Ig 折叠结构域是否在分泌及对 PDZ 结构域的依赖中发挥作用。删除 His 标记的 VesB?20 的 Ig 折叠结构域会导致蛋白不稳定，无法通过抗 His 或 VesB 抗体检测。因此，研究人员采用替代策略，将 VesB、VesA、VesC 的蛋白酶结构域替换为周质酶 β- 内酰胺酶，构建三种 β- 内酰胺酶嵌合体（β-lac:B、β-lac:A、β-lac:C），并通过检测硝基头孢菌素水解评估其 T2SS 分泌情况。结果显示，WT 霍乱弧菌中 β-lac:A 和 β-lac:C 仅约 5% 分泌到上清，与天然 β- 内酰胺酶相似；而 β-lac:B 的分泌量显著更高（42%）。重要的是，epsC?PDZ 突变体中 β-lac:B 的上清活性未增加，表明 VesB 的 Ig 折叠可引导 β- 内酰胺酶以 PDZ 依赖方式分泌到胞外。
为确定 VesB 的 Ig 折叠是否与 PDZ 结构域相互作用，研究人员用纯化的 PDZ 进行 β-lac:B 下拉实验。将 EpsC 的 PDZ 结构域进行 N 端 AVI 标记和纯化，用纯化的 BirA 进行生物素化，然后结合到链霉亲和素 - 琼脂糖树脂上。将霍乱弧菌表达 β-lac:B 的过夜培养上清与 PDZ 结合珠或对照珠孵育，结果显示 PDZ 结合珠捕获的 β-lac:B 量显著更高。这些数据表明，VesB 的 Ig 折叠结构域含真正的 PDZ 依赖分泌信号，嵌合 β-lac:B 的分泌可能通过与 EpsC 的 PDZ 结构域直接相互作用促进。
讨论
此前研究表明，缺失或失活 T2SS 组件（如 epsD、epsE 等）会导致霍乱弧菌生长不良、胞外应激、膜泄漏及筛选出抑制突变体。本研究显示，表达 EpsC?HR 无法互补 epsC::kan 突变体的生长缺陷和丝氨酸蛋白酶分泌；而表达 EpsC?PDZ 的 epsC::kan 突变体生长速率与 WT 无差异，但无法互补上清丝氨酸蛋白酶活性。这是因为 PDZ 结构域缺失对霍乱弧菌 T2SS 功能影响有限，仅显著影响丝氨酸蛋白酶 VesB 的分泌。关于 T2SS 严重破坏导致上述表型的原因，最可能的解释是 T2SS 失活使分泌酶滞留周质，其脱靶活性导致细胞毒性。VesC 是候选因素，因部分 eps 突变体含 vesC 失活突变，但本研究发现，即使少量 VesC 滞留会诱导 epsC?PDZ 突变体的 RpoE 应激反应，VesC 也并非 T2SS 突变体生长缺陷的唯一原因，缺失整个 epsC-epsN 操纵子的?eps 突变体即使缺失 vesC 仍生长不良。可能的原因是周质滞留酶（如 VesC）的复合作用及胞外酶功能丧失。
定量质谱显示，在霍乱弧菌近 24 种 T2SS 底物中，仅 VesB 的分泌受 PDZ 结构域缺失显著影响。对 VesB 及其同源物的 Western blot 分析证实 VesB 分泌依赖 PDZ 结构域，而 VesA 和 VesC 的分泌仅受轻微影响。此前研究发现 Dickeya dadantii 的果胶酸裂解酶同源物分泌受 PDZ 结构域缺失的影响不同，本研究中 Ves 蛋白酶的情况与之类似，进一步证实 EpsC 及其同源物的 C 端区域是 T2SS 的重要组件，仅调控部分底物分泌。意外的是，epsC?PDZ 突变体上清中 LuxP、LptE、VCA0212 和 VC2622 的丰度也降低。这些蛋白定位于周质或外膜内叶，WT 上清中的少量存在可能源于外膜囊泡（OMVs），其在 epsC?PDZ 突变体中丰度降低可能是因周质
