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溶血曼海姆菌是牛呼吸道疾病（BRD）关键致病菌。研究发现其在厌氧条件下通过同源重组（HR）和简单序列重复（SSR）滑链错配产生相位变异，核糖体 RNA 操纵子重组仅见于厌氧环境，甲基化及转录组存在差异。这挑战静态基因组观，提示需建立动态模型，为 BRD 防控及 antimicrobial stewardship 提供新视角。
研究背景与意义
溶血曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）是牛呼吸道疾病（bovine respiratory disease, BRD）的关键致病菌，也是肉牛养殖场抗生素使用的主要驱动因素。作为一种兼性厌氧菌，它常存在于健康牛的上呼吸道，但在厌氧条件下对 BRD 的作用尚未被深入研究，尽管厌氧环境在人类呼吸道感染中的重要性已得到证实。传统研究认为细菌基因组是稳定的静态序列，依赖单一分离株的基因组测序和单核苷酸多态性（SNPs）追踪变异。然而，本研究通过多组学方法反驳了 “溶血曼海姆菌基因组序列独立于环境” 的零假设，揭示了厌氧条件驱动的基因组可塑性可能在其从共生状态向致病状态转变中发挥关键作用，强调了建立动态基因组模型的必要性。
研究方法
研究以溶血曼海姆菌 USDA-ARS-USMARC-184 菌株为研究对象，采用长读长测序技术对有氧和厌氧培养条件下的菌落形态变异株进行全基因组组装，消除扩增偏差并准确解析简单序列重复（simple sequence repeats, SSR）长度变异和同源重组（homologous recombination, HR）边界。通过结晶紫染色观察菌落形态变化；利用 PacBio 和 Oxford Nanopore 测序技术进行基因组和转录组分析，结合 Phobos 软件识别 SSR，通过 Pathway Tools 和 Geneious Prime 进行通路富集和差异表达分析，探究厌氧与有氧条件下基因组、甲基化及转录组的差异。
研究结果
基因组组装与菌落形态
研究获得了所有子分离株的闭合环状基因组组装结果。菌落形态观察显示，厌氧培养第 1 天同时存在光滑（smooth）和非光滑（nonsmooth）表型，第 3 天非光滑菌落比例增加，第 8 天则减少。早期非光滑菌落较大，随厌氧培养时间延长呈现光滑 / 非光滑混合外观，且同一接种条件下不同容器的菌落数量和表型比例存在差异。
同源重组的环境特异性
将第 3 天厌氧培养基因组与参考亲本序列比对，发现光滑（3/4 基因组）和非光滑（2/4 基因组）变异株中均存在核糖体 RNA（rRNA）操纵子间的同源重组，表现为局部共线区块（LCB）重排；而非厌氧培养的基因组无论菌落形态如何，均未检测到同源重组。非光滑变异株中观察到的两种 LCB 重组构型也存在于光滑变异株中，且光滑变异株还存在独特构型，共鉴定出四种不同 LCB 构型，表明厌氧条件是 rRNA 操纵子同源重组发生的必要条件。
SSR 与甲基化调控
亲本基因组含 7 个预测的 DNA 甲基转移酶（MTase）基因，其中两个 5' 端含长于 30 bp 的 SSR。M.Mha184VI（重复单元 ACAGCCG）和 M.Mha184ORF16130P（重复单元 ACAGC）均为 N6 - 甲基腺苷（m6A）转移酶，分别靶向 5'-GACAT 和 5'-GTTAT 基序。滑链错配（slipped strand mispairing, SSM）导致这些基因在参考基因组中被注释为两个开放阅读框（ORFs）。厌氧分离株的 SSR 长度变异支持移码现象，无 SSR 的 MTase 基因在所有分离株中持续活跃，而含 SSR 的 MTase 活性随 SSR 长度和培养条件变化。
M.Mha184VI 需 85 bp SSR（12 次重复）形成功能 ORF，亲本基因组因 11 次重复而无活性；有氧分离株均含 12 次重复且靶基序被修饰，厌氧分离株则表现出活性差异，非光滑株保留功能活性，部分光滑株因重复单元增加破坏 ORF 而无修饰，SSR 长度与 MTase 活性完全相关。M.Mha184ORF16130P 预测需 155 bp SSR（31 次重复）有功能，但有氧分离株仅 27-29 次重复且无靶基序修饰；厌氧分离株预测与实际活性存在不一致，部分非光滑株出现与预测相反的甲基化现象。其他基因（如糖基转移酶、脂蛋白）的 SSR 长度与参考基因组一致。
厌氧条件对甲基化比例的影响
五种 MTase 的靶基序修饰比例分析显示，厌氧培养中 Dam 和 III 型 MTase 的 median 修饰比例显著增加（0.06%-4%），而 I 型 MTase 无显著差异，表明厌氧条件对特定类型甲基化存在微妙但有统计学意义的影响。
厌氧变异株的转录组差异
非光滑和光滑变异株的转录组分别获得 458,341 和 690,715 条映射到参考基因组的 reads。差异丰度比（DAR）分析显示，硝酸盐还原酶 IV 通路和基因本体（GO）“翻译”（核糖体蛋白）相关基因转录本存在显著差异。非光滑株中硝酸盐还原通路基因转录本丰度较高（正 log2DAR），核糖体蛋白基因转录本丰度较低（负 log2DAR），且核糖体蛋白基因位于复制起点（oriC）附近。
功能分类显示，rRNA 操纵子边缘的 tRNA（tRNA riboOpEdge）和 16S 与 23S 之间的 tRNA（tRNA ribo16S23S）的 DAR 分布较基因间 tRNA 更广泛，其中 tRNA-Asp 在 tRNA riboOpEdge 中 DAR 最高，tRNA-Ile 在 tRNA ribo16S23S 中 DAR 最低。“厌氧相关”“转运蛋白”“外膜蛋白（OMP）” 基因多呈正 DAR，TRAP 转运蛋白小通透酶组件基因 DAR 最高，且与感受态基因comEA等均位于 oriC 附近。“DNA 代谢” 基因（recX、ruvC等）在非光滑变异株中转录本丰度增加；“翻译调控” 基因（ssrA tmRNA、RelE/ParE毒素等）多呈正 DAR，仅 23S rRNA 积累蛋白YceD呈负 DAR。
讨论
厌氧条件下的转录调控与适应
非光滑变异株中硝酸盐还原 IV 通路的激活不依赖硝酸盐存在，可能通过低氧分压（pO2）调控，且基因组含甘油 - 3 - 磷酸至延胡索酸电子传递通路基因，可能支持厌氧生长。rRNA 操纵子同源重组为溶血曼海姆菌中首次发现，rRNA 操纵子附近 tRNA 的 DAR 分布差异表明，同源重组介导的相位变异可能通过调整 tRNA 库增强环境适应能力。
基因剂量与持留表型
非光滑变异株核糖体蛋白转录水平降低，表明代谢活性减弱，这些基因靠近 oriC 的位置与其在有利条件下快速生长的功能一致。非光滑株呈现持留菌样表型特征：核糖体蛋白下调、应激响应和翻译调控基因上调，硝酸盐还原、DNA 修复及感受态基因转录本丰度增加，提示厌氧条件可能促进 DNA 交换和重组，增加抗生素暴露下通过转化形成新基因组及耐药性的风险。
甲基化与动态基因组模型
光滑与非光滑变异株整体甲基化比例无显著差异，但厌氧与有氧条件下 Dam 和 III 型甲基化的细微差异可能具有重要生物学意义。相位变异的随机性和可逆性要求建立动态基因组模型，基于 HR 和 SSR 组合计算，该菌株至少存在 16 种理论相位变异构型，需通过贝叶斯网络等方法结合实验数据构建概率模型，预测不同环境下同源重组体和 SSR 开关的概率。
结论
研究证实溶血曼海姆菌基因组受培养氧水平影响：厌氧条件诱导染色体倒位和 SSR 长度变异，有氧条件仅存在 SSR 变化。厌氧非光滑变异株表现出硝酸盐还原 IV 通路激活和核糖体蛋白转录减少，与持留状态一致。组学分析表明相位变异和基因剂量影响适应、感受态及持留能力，对 antimicrobial 耐药性防控具有启示意义。厌氧与有氧条件下 Dam 和 III 型甲基化差异需进一步研究。研究呼吁建立动态基因组模型，整合环境诱导的相位变异随机性，为理解溶血曼海姆菌基因组生物学及其在牛呼吸道疾病中的作用提供新框架。
