PAD4与肌球蛋白-9运动复合体关联揭示类风湿关节炎中异常瓜氨酸化的分子机制

研究人员针对类风湿关节炎(RA)中蛋白精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)异常激活机制不明的问题，通过质谱分析、免疫共沉淀和荧光显微技术，首次发现PAD4与肌球蛋白-9(MYH9)运动复合体形成功能性互作网络。该研究揭示了MYH9介导的PAD4胞内转运机制，发现RA患者中MYH9复合体特异性瓜氨酸化现象，为理解RA自身抗原产生提供了新视角。

　　

类风湿关节炎(RA)作为一种自身免疫性疾病，其典型特征是患者体内出现针对瓜氨酸化蛋白的自身抗体(ACPA)。蛋白精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)是催化精氨酸残基转化为瓜氨酸的关键酶，但长期以来存在两大谜团：一是PAD4需要毫摩尔级钙离子(Ca²⁺)才能在体外激活，而细胞内Ca²⁺浓度仅纳摩尔级；二是PAD4如何选择性地在RA患者中产生病理性的瓜氨酸化修饰。这些问题的解答对理解RA发病机制至关重要。

华盛顿大学的研究团队通过系统性研究，首次揭示了PAD4与肌球蛋白-9(MYH9)运动复合体的功能关联。这项发表在《Journal of Biological Chemistry》的研究，综合运用了免疫共沉淀-质谱联用技术(LC-MS/MS)、免疫荧光显微术、邻近连接分析(PLA)等方法，研究对象包括30例RA患者和20例健康对照者的中性粒细胞，以及转染PAD4的293T细胞模型。

主要技术方法
研究采用免疫共沉淀结合高精度Orbitrap质谱，鉴定出PAD4互作蛋白网络；通过构建PAD4 N/C端GST融合蛋白明确结合域；利用邻近连接分析验证蛋白互作距离(<40nm)；采用blebbistatin抑制MYH9马达域研究PAD4定位变化；通过ELISA检测RA患者血清对MYH9瓜氨酸肽段的特异性抗体。

研究结果

质谱分析PAD4共免疫沉淀蛋白
从RA患者中性粒细胞中鉴定出16种与PAD4稳定互作的蛋白，其中MYH9在所有样本中均被高丰度检出。值得注意的是，健康对照仅检出MYH9，提示RA患者存在更复杂的PAD4互作网络。

转染非造血细胞的免疫共沉淀
在表达HA标记PAD4的293T细胞中，MYH9仍能与PAD4共沉淀，证明该互作不依赖中性粒细胞特异性蛋白。

PAD4 N/C端结合蛋白
GST pull-down实验显示，PAD4 C端主要结合烯醇酶1(ENO1)、grancalcin(GCA)和vinculin(VCL)，而N端偏好结合中性粒细胞胞质因子1(NCF1)，揭示PAD4通过不同结构域组织互作网络。

MYH9共免疫沉淀蛋白的质谱分析
反向实验证实PAD4存在于MYH9免疫沉淀物中，且共享CAPZB、FLNA等8种互作蛋白，支持PAD4-MYH9形成超大分子复合体的假说。

免疫荧光共定位
在RA患者中性粒细胞中，PAD4与MYH9、MYL6等呈现明显的胞质共定位，但核内PAD4不与MYH9共存。blebbistatin处理导致PAD4分布弥散化，证实MYH9马达活性对PAD4精确定位的关键作用。

邻近连接验证
PLA检测显示PAD4与MYH9、GCA等蛋白的互作距离在RA患者中显著增强，其中GCA信号最强，暗示其可能独立于MYH9与PAD4直接作用。

MYH9复合体的瓜氨酸化
质谱鉴定出MYH9的R867、R1703等5个瓜氨酸化位点，以及MYL6 R94、MYL12A R132的修饰，这些修饰仅存在于RA患者样本。ELISA证实约30% RA患者血清识别这些瓜氨酸化表位。

结论与意义
该研究首次描绘了PAD4-MYH9运动复合体的精细互作图谱，提出"MYH9运输系统调控PAD4空间定位"的新机制：在生理状态下，MYH9通过其马达活性将PAD4运送至特定胞质位点；当RA患者中性粒细胞遭遇细胞毒性淋巴细胞攻击时，穿孔素孔道介导的钙流促使PAD4-MYH9解离，PAD4在GCA伴随下转位至核内。研究还揭示了MYH9复合体在RA中的病理学瓜氨酸化特征，这些修饰表位可被ACPA识别，为理解RA自身抗原起源提供了分子基础。

这项发现不仅解决了PAD4在低钙环境下激活的长期争议，更提出了"运动复合体介导的酶空间调控"新范式，为开发靶向PAD4运输通路的RA治疗策略奠定了理论基础。特别值得注意的是，MYH9 R867等瓜氨酸化表位具有RA特异性，可能成为疾病诊断的新生物标志物。