Hsp70分子伴侣变构调控的动态结构框架研究

研究人员针对Hsp70分子伴侣变构信号传导的时空组织机制不明的问题，通过构建DnaK变体结合荧光淬灭技术，揭示了ATPγ-磷酸基团几何构型对变构信号启动的关键作用，阐明了T11-F146-D393-R151-K414-D481等关键残基在信号传递中的层级关系，为理解Hsp70变构调控提供了动态结构模型。

　　

在生命活动中，蛋白质的正确折叠与功能维持至关重要，而分子伴侣Hsp70（热休克蛋白70）家族作为细胞内的"蛋白质折叠工程师"，通过精巧的变构机制调控其与客户蛋白（client）的相互作用。然而，这个变构机制如何感知ATP信号并将信号从核苷酸结合域（NBD）传递到底物结合域（SBD）？不同结构域间如何协同运作？这些问题长期困扰着科学家。德国海德堡大学分子生物学中心（Zentrum für Molekulare Biologie der Universit?t Heidelberg）的Matthias P. Mayer团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的研究，通过时间分辨的荧光淬灭技术，首次描绘出Hsp70变构调控的动态结构框架。

研究采用HiLyte Fluor? 488标记的DnaK双半胱氨酸变体，结合停止流荧光技术监测5-15?范围内的构象变化。通过系统分析ATP类似物（ATPαS/ATPγS/AMPPNP等）和关键位点突变体（T11G/F146A/D393A等）对构象动力学的影响，建立了从ATP结合到SBD构象改变的全链条信号传递路径。

研究结果显示：1）ATPγ-磷酸基团的几何构型和电负性是启动变构信号的关键，ATPαS能诱导类似ATP的构象变化但速率降低64%；2）NBD残基T11作为γ磷酸的主要传感器，其突变（T11G）显著延缓亚域旋转；3）连接肽D393A突变虽不影响连接肽插入速率，但破坏SBDβ与NBD的稳定对接；4）界面残基R151A和K414I分别使SBDβ对接速率降低2000倍和4倍，证实SBD-NBD对接是α螺旋盖（lid）打开的前提；5）D148A突变体揭示客户蛋白通过疏水通路（I438-V440-L484-D148）触发ATP水解所需的构象逆转。

特别值得注意的是，长时程荧光监测发现变构缺陷突变体（如R151A）会自发从ATP结合态（DnaK^R）转变为类似底物结合态（DnaK^S），该状态中SBDβ相对NBD旋转180°且界面稳定作用消失。这一发现解释了为何界面突变体（如D481A）具有基础ATP酶活性升高的现象。

该研究通过整合时间分辨的构象动力学数据与生化特征，提出Hsp70变构调控的三阶段模型：1）ATP通过T11/K70感知触发NBD亚域旋转；2）连接肽插入稳定亚域构象，促进SBDβ对接；3）客户蛋白结合诱导SBDβ解离并旋转，形成ATP水解过渡态。这一框架不仅解释了数十年来积累的Hsp70突变体表型，还为开发靶向变构通路的分子伴侣调节剂奠定基础。研究揭示的变构信号层级传递原则，对其他AAA+ ATP酶家族的变构机制研究也具有重要启示意义。