线粒体孔蛋白Por1六聚体结构揭示其在蛋白质输入、脂质翻转及mtDNA维持中的多功能机制

本研究针对线粒体外膜关键β-桶状通道蛋白Por1（VDAC）的寡聚体功能展开深入探索。通过3.2?冷冻电镜解析酵母Por1六聚体结构，研究人员发现其界面突变体可影响TOM复合体组装从而调控MIA途径蛋白输入，通过分子动力学模拟证实六聚体界面具有磷脂翻转酶活性，并鉴定出Q194A突变导致mtDNA丢失与7个核酸酶（MDL蛋白）相关的分子机制。该研究突破性地揭示了Por1超越代谢物转运的多重生物学功能，为理解线粒体质量控制提供新视角。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其功能实现依赖于内外膜间精密的分区化调控。外膜上的电压依赖性阴离子通道（Voltage-dependent anion channel, VDAC/孔蛋白Porin）长期以来被认为仅是代谢物被动扩散的"看门人"，但越来越多的证据表明这个由19个β-折叠片构成的桶状蛋白可能隐藏着更复杂的生物学功能。由于缺乏高分辨率的天然寡聚体结构，Porin在蛋白质转运、脂质代谢和线粒体DNA（mtDNA）维持等过程中的分子机制始终笼罩着神秘面纱。

来自日本名古屋大学（Nagoya University）的研究团队在《Nature Communications》发表的研究成果，通过冷冻电镜首次解析了酵母Por1（VDAC同源蛋白）六聚体的3.2?高分辨率结构。基于这一结构蓝图，研究人员设计系列界面突变体，系统揭示了Por1在蛋白质输入、膜脂质动态平衡和mtDNA维持中的三重功能机制。这项研究不仅为理解线粒体外膜的功能整合提供了新范式，更开辟了通过靶向Por1寡聚体界面调控线粒体质量的新思路。

研究团队运用冷冻电镜解析Por1六聚体结构，通过分子动力学模拟分析脂质翻转活性，采用蓝绿温和胶电泳（BN-PAGE）和交联实验验证体内组装状态，建立酵母突变体模型评估蛋白质输入效率，结合定量PCR和荧光显微术追踪mtDNA动态变化。特别值得注意的是，通过系统性筛选26种核酸酶相关基因，鉴定出7个与mtDNA丢失相关的关键因子（MDL蛋白）。

【结构特征揭示组装机制】
冷冻电镜结构显示Por1六聚体呈现伪二重对称性，由两个三聚体反向排列构成，整体尺寸达170?×90?×35?。每个原体保留典型的19链β-桶状结构，但N端区域（1-13位残基）部分形成α-螺旋插入桶内孔道。与原核表达的重组单体VDAC不同，天然六聚体界面存在特异的亲水和疏水相互作用网络，包括T33-Q194、R252-D228等关键残基对。高速原子力显微镜（HS-AFM）观察证实该六聚体在天然膜环境中真实存在。

【蛋白质输入调控新机制】
通过构建D228K/R252E（KE）双突变体，研究发现Por1六聚体通过结合游离的Tom22（线粒体蛋白质输入门控TOM复合体的核心组分），延缓其重新组装入三聚体TOM复合体，从而促进形成缺乏Tom22的二聚体TOM——这正是线粒体膜间隙（IMS）MIA途径底物输入的必需构象。当Por1-Tom22相互作用被KE突变破坏时，TIM9/10等MIA途径蛋白的输入效率显著降低，而TIM23途径的基质蛋白输入不受影响。

【脂质翻转酶活性发现】
分子动力学模拟揭示六聚体界面存在特异的磷脂翻转路径：在B/C和B'/C'界面，保守的极性残基（如Q73）排列形成亲水通道，使磷脂头部基团能跨越疏水核心完成翻转。实验证实界面突变体T33A/D228A/Q249A（TDQ）虽保留代谢物转运功能，却导致心磷脂（CL）含量显著降低。值得注意的是，人类VDAC1中Q73E突变可增强翻转活性，暗示哺乳动物中该功能可能更为重要。

【mtDNA维持的分子开关】
Q194A（QA）突变体意外引发mtDNA快速丢失现象：3小时内mtDNA水平骤降至30%，且伴随线粒体形态异常。通过全基因组筛选发现，缺失Mkt1、Mus81等7种MDL蛋白可挽救QA突变体的mtDNA丢失。荧光定位显示这些核酸酶主要分布于线粒体基质或膜间隙，在QA背景下mtDNA片段会异常聚集于线粒体周边区域。这表明Por1六聚体可能通过某种尚未明确的信号传导机制，调控这些核酸酶对mtDNA的访问权限。

这项研究突破性地重新定义了Por1的生物学角色——它不仅是简单的代谢通道，更是整合线粒体外膜多项关键功能的分子枢纽。六聚体界面形成的特殊结构为理解蛋白质-脂质-核酸的跨膜调控提供了全新视角：通过动态结合Tom22调控蛋白质输入门控的构象转换；作为首个被证实的真核生物膜脂质翻转酶参与膜组成重塑；与核酸酶网络协同维持mtDNA稳定性。这些发现为治疗线粒体功能障碍相关疾病（如神经退行性疾病和炎症性疾病）提供了潜在新靶点——靶向Por1寡聚体界面可能实现对线粒体质量控制的多重调控。特别值得关注的是，人类VDAC1已被证明与炎症小体激活和自身免疫疾病相关，本研究揭示的mtDNA泄漏机制为理解这些病理过程提供了分子基础。